HBV基因定量分析技術的應用價值、存在問題及展望--HBV基因定量分析技術的應用價值

HBV基因定量分析技術的應用價值、存在問題及展望--HBV基因定量分析技術的應用價值

作者：繆曉輝 孔憲濤

近年來HBV基因定量分析的價值受到越來越多研究者的重視[1]。過去由于過分強調了HBV感染后過強的細胞免疫應答介導肝細胞損傷，忽視了對病毒復制水平與致病性之間因果關系的研究。目前普遍認為，盡管HBV不直接破壞寄生細胞，但病毒的活躍復制是啟動或激發(fā)肝臟組織炎癥反應的因素。這表明確定感染者體內HBV復制狀態(tài)，即從HBV基因定量的角度作病情分析是十分有意義的。事實上，真正引起人們關注HBV基因定量分析價值的重要原因是最近發(fā)現了干擾素治療與HBV基因水平兩者之間有非常密切的關系。HBV基因定量分析還在轉基因動物、基因治療、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV藥物體外試驗和動物試驗及耐藥研究、流行病學研究、HBV血液制品污染監(jiān)測等方面具有重要的應用價值。

一、HBV基因定量分析在干擾素治療中的應用

尚無藥物可以清除所有HBV感染者體內HBV顆粒。干擾素是目前唯一有一定療效的一類生物制劑[2],它在病毒等誘導下由幾種相關細胞產生，并發(fā)揮抗病毒作用。但是無論使用何種干擾素，也無論治療劑量或療程如何，干擾素治療后HBV轉陰率迄今仍保持在40%左右，無法進一步提高，究竟有哪些制約因素起作用尚無定論。

近年來發(fā)現干擾素的治療效果，即干擾素治療后的反應性(response)很大程度上取決于HBV在體內的復制水平[2,3]。以下幾點事實值得注意:⑴治療前HBV低水平復制者的反應性明顯優(yōu)于高水平復制者。HBV轉陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA含量較低者，而治療前HBV DNA含量特別高者大多沒有療效；⑵治療中病毒復制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治療期間HBV基因水平下降較慢，或下降幅度較小，或變化不明顯者，大多是無效者；⑶治療結束后，采用PCR定量法檢測，HBV DNA完全轉陰者可能不再復發(fā)，而終止治療后HBV DNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大?？梢?，使用干擾素治療HBV感染時，在各種近期和遠期療效指標中，除了病人的臨床表現是否好轉，生化指標(ALT)是否改善，肝組織炎癥反應是否減輕等以外，血清HBV DNA定量分析是一個十分重要的觀察項目。從現有研究資料看，除病理檢查外，HBV DNA定量檢測，也許是干擾素治療效果判斷依據中最直接、最可靠和最有價值的指標。多數研究者認為，通過HBV DNA定量分析來指導干擾素治療，有重大意義。首先，在治療對象的選擇方面，即確定干擾素治療適應癥時，應對各侯選病例在某個時間段內定期反復檢?釮BV DNA水平，那些長期保持HBV高復制水平者不宜接受干擾并素治療，或應當聯合治療；其次，干擾素治療期間，可根據HBV基因水平的動態(tài)變化適時調整治療劑量，決定是否縮短或延長療程，及是否終止治療。這不僅對制訂合理的治療方案，也對減輕病人負擔，避免不恰當用藥有指導意義[4]。筆者認為，目前國際上普遍采用的所謂“六個月療程”及某些中高劑量治療方案均缺乏充分和足夠的立論依據，有必要結合基因定量分析結果，重新評價和制訂干擾素治療計劃；最后，干擾素治療結束后，對有反應者定期作定量分析，有助于發(fā)現復發(fā)者，并根據血清HBV DNA含量波動情況決定是否實施再治療。有人報告，首次干擾素治療有效者，再治療的效果亦佳。如果第一次治療無反應或反應較差者，第二次干擾素治療仍不能取得理想療效[5]。

二、HBV基因定量分析的其他臨床價值

HBV感染后，在臨床表現方面的差異非常明顯,可以表現為無癥狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、暴發(fā)型肝炎、肝硬化及肝癌等多種疾病狀態(tài)。病毒在肝細胞內的復制水平與各種臨床疾病狀態(tài)之間可能存在著某些必然聯系。由于HBV基因定量技術的發(fā)展和成熟，目前已有可能從某些現象上闡明HBV復制與致病性之間的“量效”關系。

㈠“無癥狀攜帶者”可能為活動性乙肝患者[6]。有部分HBV感染者，由于免疫耐受或其它原因，體內HBV呈復制不活躍的“潛伏”狀態(tài)，但并不意味著不存在進行性肝損害。Mels等研究發(fā)現無癥狀攜帶者在其自然發(fā)展史上，HBV復制處于波動狀態(tài)，時有加劇，病毒復制積累到一定程度后ALT水平增加。一般規(guī)律是:血清HBV DNA水平上升? ALT活性增加? IgM抗HBc滴度提高。因此無癥狀攜帶者應采取積極治療措施，否則這類人群不僅作為重要的病毒庫傳播HBV，而且由于隱匿性肝細胞損傷的不斷積累，不經過慢性肝炎階段，直接向肝硬化和肝癌發(fā)展。

㈡HBV DNA水平與HBV感染者病情和預后的關系密切。上述無癥狀攜帶者是一個特殊群體。而對那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，HBV DNA水平對預后判斷有幫助。研究發(fā)現HBV DNA一直保持較高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV復制水平較高的慢性肝炎患者不僅對干擾素治療的反應性差，而且肝組織炎癥反應更明顯，病情更重，更易發(fā)生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA水平來判斷肝組織炎癥損傷程度這類問題上尚有爭議。動物實驗表明，鴨肝被DHBV廣泛感染的同時，并不伴隨明顯病毒血癥,肝細胞清除病毒的同時也無病毒血癥加重的證據[7]。然而最近有人對HCV感染者進行基因定量分析研究，發(fā)現HCV RNA水平與ALT水平以及肝臟knodell分級之間有密切關系[8]。

㈢肝移植者HBV DNA定量的意義

Mazzaferro等報告肝移植前患者血清HBV DNA水平的高低決定移植后肝臟是否再感染HBV[9]。作者觀察到，14例移植前血清HBV DNA含量低于103拷貝/ml，移植后不間斷地采用HBsAb免疫預防，隨訪36個月，無一例再發(fā)肝炎，但另外兩例移植前病毒拷貝數大于105/ml則發(fā)生了嚴重HBV再感染。建議移植前使用抗HBV藥物，最大限度降低血清HBV DNA濃度，有助于防止HBV侵犯移植后肝臟，提高肝臟移植的效果。

㈣前核基因突變HBV定量意義

HBV前核基因突變可導致HBeAg表達缺失。感染不表達HBeAg的HBV突變株，或野生型HBV在體內突變并成為優(yōu)勢株均產生較嚴重的后果，如易發(fā)生暴發(fā)性肝炎，預后差，干擾素治療無效等[9,10]。目前已能采用核酸序列測定技術、PCR技術、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析技術等來定性檢測HBV前核基因突變。最近Baxall建立了一種PCR及產物的顯色反應點突變分析技術(Colourimetric point mutation assay)，用來定量分析突變前核基因，有助于進一步探討HBV突變與致病性之間的關系[11]。

基因定量分析是一項臨床應用型技術，但對基礎研究也有一定的應用價值[12]，尤其是在當前基因治療、轉基因動物、核酸疫苗等熱點研究領域，基因定量分析可能是一種很好的輔助手段，對發(fā)現一些有意義的現象也許有一定幫助。比如HBV在轉基因小鼠組織臟器分布規(guī)律可用定量標準來衡量，以及用定量手段觀察各種藥物、細胞因子和其它物質對轉基因小鼠HBV基因復制的調節(jié)作用。又如對核酸疫苗注入肌組織后的各種動力學變化的研究遠未深入，如能采用定量手段，分析抗原表達基因在體內的存在狀態(tài)無疑是有益的。至于各種抗HBV藥物，無論是在體外細胞模型(包括轉基因細胞模型)還是在動物模型的研究，或在人體研究，采用基因定量分析，應當是考核藥物療效的最佳手段[13]。

HBV因定量分析存在的問題及未來展望

HBV基因定量技術的發(fā)展歷史不長，但由于有定性技術為基礎，以及與其它學科方法的融匯，發(fā)展速度很快，目前趨于成熟。但應用定量技術去研究HBV感染的臨床問題還不充分，同時定量技術本身也有許多問題值得探討。

一、國際標準化。這是一個最為突出而又必須盡快解決的問題。歐洲有一個“病毒性肝炎研究組”（European Study Group in Viral Hepatitis)，經常向歐洲的某些研究機構提供HBV血漿標準品作定量分析參考[14]。有必要在國際上設立統(tǒng)一的HBV基因標準品，包括各種HBV亞型的標準參照。筆者認為，克隆的HBV DNA質粒不適宜作標準品。克隆HBV DNA與載體構成了閉環(huán)超螺旋結構，而且，一級結構單一，這與體內存在的HBV基因結構差異很大。后者呈部分雙鏈，在血清中尚有裂解片段及復制中間體等形式。因此，無論是在分子雜交，還是在PCR過程中，質粒HBV DNA結構與人體內感染的HBV DNA結構在雜交效率或擴增效率上必然有細微差別，結果將影響定量分析的準確性。如從高水平HBV陽性病人血清大量抽提，或從轉基動物血液中純化得到HBV DNA，可能是一個制備標準品的途徑?？傊瑖H化的標準參照，是保證HBV DNA定量技術精確性和可靠性的前提。

二、分子雜交定量技術和PCR定量技術應當共存下去嗎?以下兩點值得考慮:首先，有必要弄清體內HBV復制水平極低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人數的比例有多大？這類低水平復制者預后如何?如果這類人群屬于急性感染恢復期，或有自然清除病毒傾向者，那么似無必要作常規(guī)PCR定量分析，定期進行PCR定性檢測即可。其次，有必要建立一種敏感度介于分子雜交和PCR定量技術之間的檢測系統(tǒng)。最近有人利用電化學技術觀察到DNA雙鏈互補雜交，甚至單個堿基對結合時發(fā)生了微電反應，這給我們以很大啟示，今后如有可能在這方面打開突破口，那么基因定量分析兩大技術共存的局面會發(fā)生轉變。但是，在目前這兩大技術仍有很強的互補性。

三、HBV突變株定量分析意義的研究。HBV基因突變[15]，尤其是前核基因突變，直接影響HBV感染病情轉歸及抗毒治療效果，同時也反映了來自體內或外界選擇壓力的作用。因此，突變株在體內產生的確切原因，突變株與野生株混合存在的發(fā)展趨向，突變株是否為耐藥株，突變株與野生株相對含量的變化與致病性的關系，突變株與免疫耐受的關系等均是有必要進一步澄清的問題。

四、基因定量技術在HBV感染流行病學方面的應用[16]。HBV經血液傳播致病已十分明確，但是體液傳播的問題還必須有充足的證據來補充。體液及其它分泌液或排泄物傳播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因，但其中必然存在“含量與傳染性”的關系，那么這個致病的量值完全可以通過HBV感染流行病學研究得到確證。另外，被污染血制品中HBV基因含量與使用血制品后感染HBV的危險性之間的關系也值得研究。

五、加強HBV低水平復制者預后研究。目前看來，所謂健康攜帶者或無癥狀帶病毒者、干擾素治療部分反應者(partial responders),以及其他種種HBV在體內呈低復制狀態(tài)者，在病情、機體免疫狀態(tài)、預后等方面可能都有一些特殊性，這類病人是否有自然清除病毒的傾向，是否應當實施抗病毒治療，是否成為重要的傳染源等問題都應該作出符合實際的回答。

六、HBV復制水平與抗病毒藥物療效之間的關系研究有待深入。筆者認為，HBV DNA水平與干擾素治療效果之間的所謂聯系在理論上缺乏根據，可能是一種表面現象，有必要探討其本質。病毒復制水平高低取決于病毒自身的生物活性和機體的免疫功能，應當從病毒和機體兩方面尋找突破口，提高干擾素抗HBV的效果。

最后，在中國，有世界上為數最眾的HBV感染及相關慢性肝病患者，但我們在HBV感染診治研究方面仍處于落后狀態(tài)。就HBV定量技術而言，目前尚未建立分子雜交定量分析技術，現已報告的PCR定量分析法也屬于低水平重復，今后有必要重視這方面的投資和開發(fā)。在臨床研究領域應當有自己的立足點，不應簡單重復國外研究結果。就HBV DNA定量分析意義的研究而言，簡單重復的現象已不鮮見，必須引以為戒。

參考文獻

1.Pawlotsky JM; Bastie A; Lonjon I,et al:What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples?J-Virol-Methods.1997;65:245.

2.Perrillo RP and Mason AL:Therapy for hepatitis B virus infection.Gastroenterol Clin North Am.1994;23:581.

3.Brunetto MR,Giarin M,Saracco G,et al:Hepatitis B virus unable to secrete e antigen and response to interferon in chronic hepatitis B.Gastroenterology.1993;105:845.

4.Ryff JC:To treat or not to treat?The judicious use of interferon-alpha-2a for the treatment of chronic hepatitis B.J Hepatol.1993;17Suppl3:S42.

5.Janssen HL,Schalm SW,Berk L et al;:Repeated courses of alpha-interferon for treatment of chronic hepatitis type B.J Hepatol.1993;17Suppl3:S47.

6.Mels GC,Bellati G,Leandro G,et al:Fluctuations in viremia,aminotransferases and IgM antibody to hepatitis B core antigen in chronic hepatitis B patients with disease exacerbations.Liver.1994;14:175.

7.Jilbert AR,Wu TT,England JM,et al:Rapid resolution of duck hepatitis B virus infections occurs after massive hepatocellular involvement.J Virol.1992;66:1377

8.Naito M,Hayashi N,Hagiwara H,et al:Serial quantitative analysis of serum hepatitis C virus RNA level in patients with acute and chronic hepatitis C.J Hepatol.1994;20:755

9.Mazzaferro V,Brunetto MR,Pasquali-M,et al.Preoperative serum levels of wild-type and hepatitis B e antigen-negative hepatitis B virus(HBV)and graft infection after liver transplantation for HBV-related hepatocellular carcinoma.J Viral Hepat.1997,4:235.

10.Brunetto MR,Randone A,Ranki M,et al:Quantitative analysis of wild-type and HBeAg minus hepatitis B viruses by a sequence-dependent primer extension assay.J Med Virol.1994;43:310.

11.Ballard AL and Boxall EH:Colourimetric point mutation assay:for detection of precore mutants of hepatitis B.J Virol Methods.1997;67:143

12.Dash S,Halim AB,Tsuji H,et al:Transfection of HepG2cells with infectious hepatitis C virus genome.Am J Pathol.1997;151:363

13.Jansen RW,Johnson LC,Averett DR:High-capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay.Antimicrob Agents Chemother.1993;37:441.

14.Erhardt A,Schaefer S,Athanassiou N,et al:Quantitative assay of PCR-amplified hepatitis B virus DNA using a peroxidase-labelled DNA probe and enhanced chemiluminescence.J Clin Microbiol.1996;34:1885

15.Moriyama K,Okamoto H,Tsuda F,et al:Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections.Virology.1996;226:269.

16.Hess G and Reuschling:Toward routine diagnosis of hepatitis B virus desoxyribonucleic acid.Clinical Biochemistry1993;26:289.

乙肝在研新藥VNRX-9945，發(fā)現和臨床前數據，即將在歐肝會宣布

2021年歐洲肝臟年會暨國際肝臟數字大會（ILC）將于歐洲中部時間6月23日至26日開始。首份HBV新藥項目完整數據，將在歐洲時間6月23日上午八點宣布（即北京時間6月23日下午兩點左右宣布，中歐地區(qū)時間差平均六小時左右）。

乙肝在研新藥VNRX-9945，發(fā)現和臨床前數據，即將在歐肝會宣布

Venatorx Pharmaceuticals和相關研究藥物VNRX-9945，將在本屆歐肝會上宣布其發(fā)現和臨床前概況。Venatorx公司專注于改善多重耐藥細菌感染和難治性病毒感染患者以實現 健康 結果。該公司成立于2010年，將于2021年6月下旬推出其抗乙肝病毒化合物（VNRX-9945）進入第1期臨床試驗。

VNRX-9945是一種乙肝病毒抑制劑，即將進入第1期臨床試驗階段。按照2021歐肝會信息披露原則，在6月23日大會開始前，全球各研究機構或媒體只可以對外介紹旗下新藥項目研究課題、總結，不可以對外將完整試驗數據早于大會披露。雖然，這些完整試驗數據已經可以在本屆歐肝會上查詢獲取，本著尊重和遵守歐肝會原則，小番 健康 將在明天開始（北京時間和歐洲時間6月24日），向各位讀者展示2021年歐洲肝臟大會上的乙肝在研新藥完整試驗數據。

Venatorx公司介紹，旗下在研新藥VNRX-9945一份海報已經被本屆歐肝會接受發(fā)表，研究課題：VNRX-9945是一種用于治療乙肝病毒感染的有效、廣泛活性核心蛋白抑制劑，闡述VNRX-9945的發(fā)現和臨床前概況（可見上圖：來自Venatorx公司，紅色方框是這項課題名稱；海報#1699）。這項課題的完整數據，將在歐肝會上介紹。

VNRX-9945是第三代（高效）、廣譜活性、口服生物可利用的核心蛋白變構調節(jié)劑（CpAM），用于治療慢性乙肝病毒感染。隨著科學研究的不斷發(fā)展，CpAM也成為了全球最具吸引力的直接作用抗病毒藥物，這一靶點可以在阻斷新病毒顆粒和cccDNA的形成。

在VNRX-9945的臨床前研究中，在體外表現出對多種乙肝病毒基因型的廣泛抗病毒活性，并且在乙肝病毒感染動物模型中的定量分析中，將乙肝病毒載量（HBVDNA）抑制至低于下限。全球包括VNRX-9945在內的高效CpAM的發(fā)現和進步，代表了一個治療HBV感染的新機會，因為CpAM和以往核苷（酸）類似物或干擾素的作用機制不同。

對CpAM和新晉在研乙肝新藥VNRX-9945的未來臨床開發(fā)前景，小番 健康 認為，這一靶標化合物可以在慢性HBV患者中實現更為深入、更完整的抗病毒抑制。CpAM這類重要乙肝新型化合物，在未來更有可能進入聯合用藥階段，以期望實現相比當前藥物更高的治療目標。

小番 健康 結語：Venatorx Pharmaceuticals，是一家美國制藥企業(yè)，于2021年3月10日宣布擴大乙肝抗感染藥物組合，即VNRX-9945。這是一種核心蛋白變構調節(jié)劑（CpAM），計劃于2021年第二季度啟動候選藥物的臨床開發(fā)。

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