看精子成熟和獲能的全過程

看精子成熟和獲能的全過程

精子在睪丸的曲細精管內(nèi)生成以后，從形態(tài)上來看，已形成蝌蚪狀精子，但經(jīng)實驗證明，睪丸內(nèi)的精子并不具備受精能力。睪丸精子還需在附睪內(nèi)經(jīng)歷精子成熟過程，以及在女性生殖道內(nèi)經(jīng)歷獲能過程。

精子在4-6米長的附睪內(nèi)運行過程中經(jīng)歷了一系列復雜的變化。精子在成熟過程中，體積略變小，含水量減少。最明顯的改變是未成熟精子體部的胞漿小滴向后移動，并最終脫下。在一些不育病人的精液中，可看見大量未脫下胞漿小滴的未成熟精子。

睪丸內(nèi)出來的精子可活動，但進入附睪頭段后，即失去活動能力。精子在附睪內(nèi)運行的過程中，又逐步獲得了活動能力。先出現(xiàn)原地擺動，然后有轉(zhuǎn)圈式運動，最后才有成熟精子特有的擺動式前向運動。因此，觀察精子的運動方式，也是衡量精子是否成熟的一個指標。

另外，在精子成熟過程中，精子膜的通透性發(fā)生改變，如對鉀離子的通透性增加，出現(xiàn)了排鈉的功能，這對酶活力及代謝有重要的影響。精子在附睪運動過程中表面負電荷增加，這可使精子在附睪內(nèi)貯存時，由于電荷同性相斥的作用，而不至于凝集成團。

還應指出，附睪的一些分泌物覆蓋于精子表面，其中有一種含唾液酸的糖蛋白。種種跡象表明，轉(zhuǎn)移到精子表面的唾液酸有著重要的生理機能：

（1）唾液酸是一種含有羧基的糖，帶有負電荷，故精子成熟過程中表面負荷增加的主要原因，即為唾液酸的增加。

（2）從免疫學角度來看，唾液酸有掩蓋精子特異抗原的機能，這就使精子在漫長的成熟及運行過程中，不致于被免疫活性細胞識別而引起自身免疫反應。先天性唾液酸轉(zhuǎn)移酶缺乏或由于細菌唾液酸酶作用，均可導致免疫不育。

（3）含唾液酸糖蛋白可穩(wěn)定頂體前區(qū)的細胞膜，從而抑制精子的頂體反應。從這個意義上講，此糖蛋白也應屬于去能因子。

射出的精子表面附著有附睪和精囊腺分泌的一種去能因子。所謂獲得過程即為去除精子表面這種因子并獲得受精能力的過程，這將使精子膜的結(jié)構(gòu)與機能發(fā)生劇烈的改變。去能因子的清除主要依靠宮頸、子宮及輸卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。所以，直接取自附睪尾的精子不具有受精能力，而把這些精子放在雌性生殖道內(nèi)若干時間后，再取出作體外受精試驗，才具有受精能力。

精子獲能以后，精子膜的不穩(wěn)定性增加，并去除了抑制頂體反應的因子，精子才可能發(fā)生頂體反應。

頂體系在精子細胞核頭端的一個特殊的結(jié)構(gòu)，它包繞在細胞核頭端的三分之二處。頂體是一特異的溶酶體，外包單層膜，呈扁平囊狀。其近細胞膜的部分稱頂體外膜，貼近核膜的部分稱頂體內(nèi)膜。內(nèi)、外膜之間的狹窄腔隙中存有均質(zhì)性的頂體內(nèi)容物，內(nèi)含糖蛋白和多種水解酶，如透明質(zhì)酸酶、唾液酸苷酶、酸性磷酸酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶和類胰蛋白酶等。精子開始發(fā)生頂體反應時，精子頂體外膜與其相貼的細胞膜發(fā)生多點融合而破裂，繼而出現(xiàn)小孔。頂體酶就是通過這些小孔釋放出去，直至頂體內(nèi)膜完全暴露。頂體反應完成的標志是頂體內(nèi)膜與精子細胞膜的完全融合。對于哺乳動物精子來說，鈣離子是激發(fā)頂體反應的必要條件。在發(fā)生頂體反應時，可見大量鈣離子內(nèi)流。在生理條件下，附睪液中鈣離子濃度低，輸卵管液中鈣離子濃度高，顯然后者有利于頂體反應。

在輸卵管內(nèi)許多精子經(jīng)歷頂體反應后釋放大量水解酶，使卵子周圍的卵丘細胞分散并去除放射冠，這樣使一些尚未發(fā)生頂體反應的精子得以與透明帶接近，相互識別。這里需要補充一句，在精子獲能過程中，由于去除了糖鏈末端的唾液酸，可使精子的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為膜內(nèi)蛋白重排成簇現(xiàn)象，這可能與精子與卵子識別有密切關(guān)系。精子與卵子透明帶結(jié)合后也發(fā)生頂體反應，釋放頂體蛋白酶，分解透明帶，逐步穿入。其中一個精子與卵細胞膜靠近，精子頂體內(nèi)膜與卵細胞膜相互融合，最終雄性原核和雌性原核合二為一，完成了受精過程。

受精過程！

精子和卵子結(jié)合的過程叫做受精或受孕，受孕就是懷孕的開始。
　　性交時，男子每次排出約2—4億個精子，其中大部分精子隨精液從陰道內(nèi)排出，小部分精子依靠尾部的擺動前進，先后通過子宮頸管、子宮腔，最后到達終點站——輸卵管壺腹部，在那里等待和卵子結(jié)合。精子從陰道到達輸卵管最快時間僅需數(shù)分鐘，最遲4—6小時，一般1—1.5小時。精子在前進過程中，沿途要受到子宮頸粘液的阻擋和子宮腔內(nèi)白細胞的吞噬，最后到達輸卵管的僅有數(shù)十條至一二百條。精子在和卵子受精前還要在女性生殖腔內(nèi)經(jīng)過一段時間的孵育后，才具有受精能力，這個過程稱為精子獲能。
　　女子在育齡期，卵巢每月排出一個成熟的卵子，排卵日期在下次月經(jīng)來潮前14天左右。卵子從卵巢排出后立即被輸卵管傘部吸到輸卵管內(nèi)，并在輸卵管壺腹部以等待精子的到來。
　　精子在女性輸卵管內(nèi)能生存1—3天，卵子能生存1天左右，如在女子排卵日前后數(shù)天內(nèi)性交，精子和卵子可能在輸卵管壺腹部相遇，這時一群精子包圍卵子，獲能后的精子其頭部分泌頂體酶，以溶解卵子周圍的放射冠和透明帶，為精子進入卵子開通道路，最終只有一條精子進入卵子，然后形成一個新的細胞，這個細胞稱為受精卵或孕卵，這個過程稱為受精。
　　受精卵從輸卵管分泌的液體中吸取營養(yǎng)和氧氣，不斷進行細胞分裂。與此同時，受精卵逐漸向?qū)m腔方向移動，3—4天后到達宮腔時已發(fā)育成為一個具有多個細胞的實體，形狀象桑椹，所以稱為桑椹胚。桑椹胚在子宮腔內(nèi)繼續(xù)細胞分裂形成胚泡，大約在受精后6—8天進入子宮內(nèi)膜，這個過程叫做著床或種植。

體外受精過程

哺乳動物體外受精的基本操作程序，主要環(huán)節(jié)包括以下幾個方面:
(一)卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)
1．卵母細胞的采集：卵母細胞的采集方法通常有三種。
(1)超數(shù)排卵：雌性動物用促卵泡素和促黃體素處理后，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中，由于操作程序復雜，成本較高，很少使用。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵子進入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時間，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。
(2)從活體卵巢中采集卵母細胞 ：這種方法是借助超聲波探測儀、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。
在家畜中， 牛和馬等大家畜常用超聲波探測儀輔助取卵，其方法是用手從直腸把握卵巢，經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針，借助B型超聲波圖像引導，吸取大卵泡中的卵母細胞。按照目前的技術(shù)水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。在家畜中，活體采集的卵母細胞一般要經(jīng)成熟培養(yǎng)后才能與精子受精。這種方法對擴繁優(yōu)良母畜具有重大意義，在有些國家已用于商業(yè)化生產(chǎn)。
(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞：這種方法是從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢，經(jīng)洗滌、保溫（30℃~37℃)后，快速運到實驗室，在無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對卵巢進行切片，收集卵母細胞。用此方法獲得的卵母細胞多數(shù)處于生發(fā)泡期(GV期)，需要在體外培養(yǎng)成熟后才能與精子受精。從廢棄卵巢中采集卵母細胞的關(guān)鍵是注意卵巢的保溫和防止細菌污染。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液（PBS）的保溫瓶中；吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌；所用溶液都要添加抗生素。
這種方法的最大優(yōu)點是材料來源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難。
2．母細胞的選擇：采集的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵丘卵母細胞復合體（cumulus oocyte complesx COC）。無論采用何種方法，采集的COC都要求卵母細胞形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻，外圍有多層卵丘細胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。A級卵母細胞要求有三層以上卵丘細胞緊密包圍，細胞質(zhì)均勻；B級要求卵母細胞質(zhì)均勻，卵丘細胞層低于三層或部分包圍卵母細胞；C級為沒有卵丘細胞包圍的裸露卵母細胞；D級是死亡或退化的卵母細胞。在體外受精實踐中，一般只培養(yǎng)A級和B級卵母細胞。
3．卵母細胞的成熟培養(yǎng)：由超數(shù)排卵采集的卵母細胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟，不需培養(yǎng)可直接與精子受精，對未成熟卵母細胞需要在體外培養(yǎng)成熟。培養(yǎng)時，先將采集的卵母細胞在實體顯微鏡經(jīng)過挑選和洗滌后，然后放入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)。家畜卵母細胞的成熟培養(yǎng)液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培養(yǎng)法，微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細胞數(shù)按每5微升一個計算單位。卵母細胞移入小滴后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養(yǎng)時間為20-24小時，卵丘卵母細胞復合體經(jīng)成熟培養(yǎng)后，卵丘細胞層擴散靠近卵母細胞周圍的卵丘細胞呈放射狀排列，出現(xiàn)放射冠，用DNA特意性染料染色后，在顯微鏡下進行核相觀察，可見卵母細胞處于第2次成熟分裂中期。
(二)體外受精
1．精子的獲能處理：哺乳動物精子的獲能方法有培養(yǎng)和化學誘導兩種方法。牛、羊的精子常用化學藥物誘導獲能，誘導獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。
2．受精：即獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng)，除鈣離子載體誘導獲能外，精子和卵子一般在獲能液中完成受精過程。受精培養(yǎng)時間與獲能方法有關(guān)。在B2液中一般為6-8小時而用TALP或S.F液作受精液時可培養(yǎng)18~24h。精子和卵子常在小滴中共培養(yǎng)，受精時精子密度為1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴體積一般為50~200微升。
(三)胚胎培養(yǎng)
精子和卵子受精后，受精卵需移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育潛力，質(zhì)量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成熟或進行冷凍保存。
提高受精卵發(fā)育率的關(guān)鍵因素是選擇理想的培養(yǎng)體系。在家畜中，胚胎培養(yǎng)液分為復雜的和化學成分明確的培養(yǎng)液兩大類。復雜培養(yǎng)液中的成分很多，除無機和有機鹽外，還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營養(yǎng)成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它們培養(yǎng)胚胎時，可以采用體細胞共培養(yǎng)體系，即體細胞與胚胎在微滴中共同培養(yǎng)，利用體細胞生長過程中分泌的有益因子，促進胚胎發(fā)育，克服發(fā)育阻斷。
受精卵的培養(yǎng)廣泛采用微滴法，胚胎與培養(yǎng)液的比例為一枚胚胎用3~10微升培養(yǎng)液；一般5~10枚胚胎放在一個小滴中培養(yǎng)以利用胚胎在生長過程中分泌的活性因子，相互促進發(fā)育。胚胎培養(yǎng)條件與卵母細胞成熟培養(yǎng)條件相同。有的實驗室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合氣體培養(yǎng)，以降低培養(yǎng)液中氧自由基濃度，提高胚胎發(fā)育率。胚胎在培養(yǎng)過程中要求每48-72小時更換一次培養(yǎng)液，同時觀察胚胎的發(fā)育狀況。當胚胎發(fā)育到一定階段時可進行胚胎移植或冷凍保存，牛、羊受精卵通常培養(yǎng)到致密桑椹胚或囊胚時進行移植或冷凍保存。

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