中藥化學(xué)提取、分離和鑒定方法

中藥化學(xué)提取、分離和鑒定方法

（一）溶劑提取法：

1．溶劑提取法的原理：溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對(duì)活性成分溶解度大，對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來(lái)的方法。當(dāng)溶劑加到中草藥原料（需適當(dāng)粉碎）中時(shí)，溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過(guò)細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。

中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可水、親本性有機(jī)溶劑及親脂性有機(jī)溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。

有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)多，其極性大而疏于油；有的親水性基團(tuán)少，其。極性小而疏于水。種親水性、親脂性及其程度的大小，是和化合物的分子結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，兩種基本母核相同的成分，其分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整分子的極性大，親水性強(qiáng)，而親脂性就越弱，其分子非極性部分越大，或碳鍵越長(zhǎng)，則極性小，親脂性強(qiáng)，而親水性就越弱。

各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如甲醇、乙醇是親水性比較強(qiáng)的溶劑，它們的分子比較小，有羥基存在，與水的結(jié)構(gòu)很近似，所以能夠和水任意混合。丁醇和戊醇分子中雖都有羥基，保持和水有相似處，但分子逐漸地加大，與水性質(zhì)也就逐漸疏遠(yuǎn)。所以它們能彼此部分互溶，在它們互溶達(dá)到飽和狀態(tài)之后，丁醇或戊醇都能與水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類或氯烴衍生物，分子中沒有氧，屬于親脂性強(qiáng)的溶劑。

這樣，我們就可以通過(guò)時(shí)中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計(jì)它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物，具有強(qiáng)親水性，極易溶于水，就是在親水性比較強(qiáng)的乙醇中也難于溶解。淀粉雖然羥基數(shù)目多，但分子大大，所以難溶解于水。蛋白質(zhì)和氨基酸都是酸堿兩性化合物，有一定程度的極性，所以能溶于水，不溶于或難溶子有機(jī)溶劑。甙類都比其甙元的親水性強(qiáng)，特別是皂甙由于它們的分子中往往結(jié)合有多數(shù)糖分子，羥基數(shù)目多，能表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性，而皂甙元?jiǎng)t屬于親脂性強(qiáng)的化合物。多數(shù)游離的生物堿是親脂性化合物，與酸結(jié)合成鹽后，能夠離子化，加強(qiáng)了極性，就變?yōu)橛H水的注質(zhì)，這些生物堿可稱為半極性化合物。所以，生物堿的鹽類易溶于水，不溶或難溶于有機(jī)溶劑；而多數(shù)游離的生物堿不溶或難溶于水，易溶于親脂性溶劑，一般以在氯仿中溶解度最大。鞣質(zhì)是多羥基的化臺(tái)物，為親水性的物質(zhì)。油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強(qiáng)親脂性的成分。

總的說(shuō)來(lái)，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng)，就會(huì)在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。

2．溶劑的選擇：運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來(lái)。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)：①溶劑對(duì)有效成分溶解度大，對(duì)雜質(zhì)溶解度??；②溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化；③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。

常見的提取溶劑可分為以下三類：

1）水：水是強(qiáng)的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無(wú)機(jī)鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽及甙類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。酸水提取，可使生物堿與酸生成鹽類而溶出，堿水提取可使有機(jī)酸、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、香豆素以及酚類成分溶出。但用水提取易酶解甙類成分，且易霉壞變質(zhì)。某些含果膠、粘液質(zhì)類成分的中草藥，其水提取液常常很難過(guò)濾。沸水提取時(shí)，中草藥中的淀粉可被糊化，而增加過(guò)濾的困難。故含淀粉量多的中草藥，不宜磨成細(xì)粉后加水煎煮。中藥傳統(tǒng)用的湯劑，多用中藥飲片直火煎煮，加溫可以增大中藥成分的溶解度外，還可能有與其他成分產(chǎn)生“助溶”現(xiàn)象，增加了一些水中溶解度小的、親脂性強(qiáng)的成分的溶解度。但多數(shù)親脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，既使有助溶現(xiàn)象存在，也不容易提取完全。如果應(yīng)用大量水煎煮，就會(huì)增加蒸發(fā)濃縮時(shí)的困難，且會(huì)溶出大量雜質(zhì)，給進(jìn)一步分離提純帶來(lái)麻煩。中草藥水提取液中含有皂甙及粘液質(zhì)類成分，在減壓濃縮時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，造成濃縮的困難。通常可在蒸餾器上裝置一個(gè)汽一液分離防濺球加以克服，工業(yè)上則常用薄膜濃縮裝置。

2）親水性的有機(jī)溶劑：也就是一般所說(shuō)的與水能混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對(duì)中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進(jìn)行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時(shí)間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機(jī)溶劑，雖易燃，但毒性小，價(jià)格便宜，來(lái)源方便，有一定設(shè)備即可回收反復(fù)使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來(lái)最常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點(diǎn)較低（64℃），但有毒性，使用時(shí)應(yīng)注意。

3）親脂性的有機(jī)溶劑：也就是一般所說(shuō)的與水不能混溶的有機(jī)溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強(qiáng)，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，價(jià)格較貴，設(shè)備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時(shí)，直接應(yīng)用這類溶劑有一定的局限性。

3．提取方法：用溶劑提取中草藥成分，、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時(shí)，原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。

1）浸漬法：浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑（如乙醇、稀醇或水），浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡(jiǎn)單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易于發(fā)霉變質(zhì)）須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?/p>

2）滲漉法：滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過(guò)藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法小當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí)，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速，在滲渡過(guò)程中隨時(shí)自藥面上補(bǔ)充新溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止?；虍?dāng)滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當(dāng)于：原藥材重的10倍時(shí)，便可認(rèn)為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀滲淮液作為另一批新原料的溶劑之用。

3）煎煮法：煎煮法是我國(guó)最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個(gè)煎煮器通過(guò)管道互相連接，進(jìn)行連續(xù)煎浸。

4）回流提取法：應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時(shí)，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶?jī)?nèi)裝藥材約為容量的％～％，溶劑浸過(guò)藥材表面約1～2cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰約：小時(shí)小放冷過(guò)濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時(shí)，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。

5）動(dòng)連續(xù)提取法：應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實(shí)驗(yàn)或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實(shí)驗(yàn)室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時(shí)才能提取完全。提取成分受熱時(shí)間較長(zhǎng)，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。

（二）水蒸氣蒸餾法：。水蒸氣蒸餾法，適用于能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的中草藥成分的提取。此類成分的沸點(diǎn)多在100℃以上，與水不相混溶或僅微溶，且在約100℃時(shí)存一定的蒸氣壓。當(dāng)與水在一起加熱時(shí)，其蒸氣壓和水的蒸氣壓總和為一個(gè)大氣壓時(shí)，液體就開始沸騰，水蒸氣將揮發(fā)性物質(zhì)一并帶出。例如中草藥中的揮發(fā)油，某些小分子生物堿一麻黃堿、蕭堿、檳榔堿，以及某些小分子的酚性物質(zhì)。牡丹酚（paeonol）等，都可應(yīng)用本法提取。有些揮發(fā)性成分在水中的溶解度稍大些，常將蒸餾液重新蒸餾，在最先蒸餾出的部分，分出揮發(fā)油層，或在蒸餾液水層經(jīng)鹽析法并用低沸點(diǎn)溶劑將成分提取出來(lái)。例如玫瑰油、原白頭翁素（protoanemonin）等的制備多采用此法。

（三）升華法：固體物質(zhì)受熱直接氣化，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。中草藥中有一些成分具有升華的性質(zhì)，故可利用升華法直接自中草藥中提取出來(lái)。例如樟木中升華的樟腦（camphor），在《本草綱目》中已有詳細(xì)的記載，為世界上最早應(yīng)用升華法制取藥材有效成分的記述。茶葉中的咖啡堿在178℃以上就能升華而不被分解。游離羥基蒽醌類成分，一些香豆素類，有機(jī)酸類成分，有些也具有升華的性質(zhì)。例如七葉內(nèi)酯及苯甲酸等。

升華法雖然簡(jiǎn)單易行，但中草藥炭化后，往往產(chǎn)生揮發(fā)性的焦油狀物，粘附在升華物上，不易精制除去，其次，升華不完全，產(chǎn)率低，有時(shí)還伴隨有分解現(xiàn)象。

分離和純化：

上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進(jìn)一步除去雜質(zhì)，分離并進(jìn)行精制。具體的方法隨各中草藥的性質(zhì)不同而異，以后將通過(guò)實(shí)例加以敘述，此處只作一般原則性的討論。

（一）溶劑分離法：一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進(jìn)行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常常為膠伏物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌人適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。例如粉防己乙醇浸膏，堿化后可利用乙醚溶出脂溶性生物堿，再以冷苯處理溶出粉防己堿，與其結(jié)構(gòu)類似的防己諾林堿比前者少一甲基而有一酚羥基，不溶于冷苯而得以分離。利用中草藥化學(xué)成分，在不同極性溶劑中的溶解度進(jìn)行分離純化，是最常用的方法。

廣而言之，自中草藥提取溶液中加入另一種溶劑，析出其中某種或某些成分，或析出其雜質(zhì)，也是一種溶劑分離的方法。中草藥的水提液中常含有樹膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使這些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而達(dá)到與其它成分分離的目的。例如自中草藥提取液中除去這些雜質(zhì)，或自白及水提取液中獲得白及膠，可采用加乙醇沉淀法；自新鮮括樓根汁中制取天花粉素，可滴人丙酮使分次沉淀析出。，提取多糖及多肽類化合物，多采用水溶解、濃縮、加乙醇或丙酮析出的辦法。

此外，也可利用其某些成分能在酸或堿中溶解，又在加堿或加酸變?nèi)芤旱膒H后，成不溶物而析出以達(dá)到分離。例如內(nèi)酯類化合物不溶于水，但遇堿開環(huán)生成羧酸鹽溶于水，再加酸酸化，又重新形成內(nèi)酯環(huán)從溶液中析出，從而與其它雜質(zhì)分離；生物堿一般不溶于水，遇酸生成生物堿鹽而溶于水，再加堿堿化，又重新生成游離生物堿。這些化合物可以利用與水不相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取分離。一般中草藥總提取物用酸水、堿水先后處理，可以分為三部分：溶于酸水的為堿性成分（如生物堿），溶于堿水的為酸性成分（如有機(jī)酸），酸、堿均不溶的為中性成分（如甾醇）。還可利用不同酸、堿度進(jìn)一步分離，如酸性化臺(tái)物可以分為強(qiáng)酸性、弱酸性和酷熱酚性三種，它們分別溶于碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉，借此可進(jìn)行分離。有些總生物堿，如長(zhǎng)春花生物堿、石蒜生物堿，可利用不同rH值進(jìn)行分離。但有些特殊情況，如酚性生物堿紫董定堿（corydine）在氫氧化鈉溶液中仍能為乙醚抽出，蝙蝠葛堿（dauricins）在乙醚溶液中能為氫氧化鈉溶液抽出，而溶于氯仿溶液中則不能被氫氧化鈉溶液抽出；有些生物堿的鹽類，如四氫掌葉防己堿鹽酸鹽在水溶液中仍能為氯仿抽出。這些性質(zhì)均有助于各化合物的分離純化。

（二）兩相溶劑萃取法：

1．萃取法：兩相溶劑提取又簡(jiǎn)稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時(shí)如果各成分兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高、如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行兩相萃取，如果有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時(shí)，多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強(qiáng)的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。不過(guò)，一般有機(jī)溶劑親水性越大，與水作兩相萃取的效果就越不好，因?yàn)槟苁馆^多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對(duì)有效成分進(jìn)一步精制影響很大。

兩相溶劑萃取在操作中還要注意以下幾點(diǎn)：

1）先用小試管猛烈振搖約1分鐘，觀察萃取后二液層分層現(xiàn)象。如果容易產(chǎn)生乳化，大量提取時(shí)要避免猛烈振搖，可延長(zhǎng)萃取時(shí)間。如碰到乳化現(xiàn)象，可將乳化層分出，再用新溶劑萃取；或?qū)⑷榛瘜映闉V，或?qū)⑷榛瘜由陨约訜幔换蜉^長(zhǎng)時(shí)間放置并不時(shí)旋轉(zhuǎn)，令其自然分層。乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重時(shí)，可以采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。

2） 水提取液的濃度最好在比重1．1～1．2之間，過(guò)稀則溶劑用量太大，影響操作。

3） 溶劑與水溶液應(yīng)保持一定量的比例，第一次提取時(shí)，溶劑要多一些，一般為水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。

4）一般萃取3～4次即可。但親水性較大的成分不易轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑層時(shí)，須增加萃取次數(shù)，或改變萃取溶劑。

萃取法所用設(shè)備，如為小量萃取，可在分液漏斗中進(jìn)行；如系中量萃取，可在較大的適當(dāng)?shù)南驴谄恐羞M(jìn)行。在工業(yè)生產(chǎn)中大量萃取，多在密閉萃取罐內(nèi)進(jìn)行，用攪拌機(jī)攪拌一定時(shí)間，使二液充分混合，再放置令其分層；有時(shí)將兩相溶液噴霧混含，以增大萃取接觸，提高萃取效率，也可采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。

2．逆流連續(xù)萃取法：是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加兩相溶劑萃取時(shí)的接觸面。例如用氯仿從川楝樹皮的水浸液中萃取川楝素。將氯仿盛于萃取管內(nèi)，而比重小于氯仿的水提取濃縮液貯于高位容器內(nèi)，開啟活塞，則水浸液在高位壓力下流入萃取管，遇瓷圈撞擊而分散成細(xì)粒，使與氯仿接觸面增大，萃取就比較完全。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進(jìn)行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行檢查。

3．逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）：逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與兩相溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的兩相溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物的分離。本法所采用的逆流分布儀是由若干乃至數(shù)百只管子組成。若無(wú)此儀器，小量萃取時(shí)可用分液漏斗代替。預(yù)先選擇對(duì)混合物分離效果較好，即分配系數(shù)差異大的兩種不相混溶的溶劑。并參考分配層析的行為分析推斷和選用溶劑系統(tǒng)，通過(guò)試驗(yàn)測(cè)知要經(jīng)多少次的萃取移位而達(dá)到真正的分離。逆流分配法對(duì)于分離具有非常相似性質(zhì)的混合物，往往可以取得良好的效果。但操作時(shí)間長(zhǎng)，萃取管易因機(jī)械振蕩而損壞，消耗溶劑亦多，應(yīng)用上常受到一定限制。

4．液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來(lái)在逆流分配法基礎(chǔ)上改進(jìn)的兩相溶劑萃取法。。對(duì)溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時(shí)間內(nèi)分離成兩相，并可生成有效的液滴。由于移動(dòng)相形成液滴，在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。且不會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，用氮?dú)鈮候?qū)動(dòng)移動(dòng)相，被分離物質(zhì)不會(huì)因遇大氣中氧氣而氧化。本法必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，且對(duì)高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量?。?克以下），并要有一定設(shè)備。應(yīng)用液滴逆流分配法曾有效地分離多種微量成分如柴胡皂甙原小檗堿型季銨堿等。液滴逆流分配法的裝置，近年來(lái)雖不斷在改進(jìn)，但裝置和操作較繁。目前，對(duì)適用于逆流分配法進(jìn)行分離的成分，可采用兩相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置或分配柱層析法進(jìn)行。

（三）沉淀法：是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，去雜質(zhì)的方法。

1.鉛鹽沉淀法：鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。因此，常用以沉淀有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等?？膳c堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡(luò)合物的范圍更廣。通常將中草藥的水或醇提取液先加入醋酸鉛濃溶液，靜置后濾出沉淀，并將沉淀洗液并入濾液，于濾液中加堿式醋酸鉛飽和溶液至不發(fā)生沉淀為止，這樣就可得到醋酸鉛沉淀物、堿式醋酸鉛沉淀物及母液三部分。

然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。含鉛鹽母液亦須先如法脫鉛處理，再濃縮精制。硫化氫脫鉛比較徹底，但溶液中可能存有多余的硫化氫，必須先通人空氣或二氧化碳讓氣泡帶出多余的硫化氫氣體，以免在處理溶液時(shí)參與化學(xué)反應(yīng)。新生態(tài)的硫化鉛多為膠體沉淀，能吸咐藥液中的有效成分，要注意用溶劑處理收回。脫鉛方法，也可用硫酸、磷酸、硫酸鈉、磷酸鈉等除鉛，但硫酸鉛、磷酸鉛在水中仍有一定的溶解度，除鉛不徹底。用陽(yáng)離子交換樹脂脫鉛快而徹底，但要注意藥液中某些有效成分也可能被交換上去，同時(shí)脫鉛樹脂再生也較困難。還應(yīng)注意脫鉛后溶液酸度增加，有時(shí)需中和后再處理溶液，有時(shí)可用新制備的氫氧化鉛、氫氧化鋁、氫氧化銅或碳酸鉛、明礬等代替醋酸鉛、堿式醋酸鉛。例如在黃芩水煎液中加入明礬溶液，黃芩甙就與鋁鹽絡(luò)合生成難溶于水的絡(luò)化物而與雜質(zhì)分離，這種絡(luò)化物經(jīng)用水洗凈就可直接供藥用。

2.試劑沉淀法：例如在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑（見生物堿性質(zhì)下），則生物堿生成不溶性復(fù)鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出。又如橙皮甙、蘆丁、黃芩甙、甘草皂甙均易溶于堿性溶液，當(dāng)加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白質(zhì)溶液，可以變更溶液的pH值利用其在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小的性質(zhì)而使之沉淀析出。此外，還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等?？筛鶕?jù)中草藥有效成分和雜質(zhì)的性質(zhì)，適當(dāng)選用。

（四）鹽析法：鹽析法是在中草藥的水提液中、加入無(wú)機(jī)鹽至一定濃度，或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無(wú)機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。例如三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都是用氯化鈉或硫酸按鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時(shí)，亦往往先在水提取液中加入一定量的食鹽，再用有機(jī)溶劑萃取。

（五）透析法：透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過(guò)半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。例如分離和純化皂甙、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等物質(zhì)時(shí)，可用透析法以除去無(wú)機(jī)鹽、單糖、雙糖等雜質(zhì)。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過(guò)半透膜進(jìn)入膜外溶液中，而加以分離精制：透析是否成功與透析膜的規(guī)格關(guān)系極大。透析膜的膜孔有大有小，要根據(jù)欲分離成分的具體情況而選擇。透析膜有動(dòng)物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜（硫酸紙膜）、蛋白質(zhì)膠膜、玻璃紙膜等。油常多用市售的玻璃紙或動(dòng)物性半透膜扎成袋狀，外面用尼龍網(wǎng)袋加以保護(hù)，小心加入欲透析的樣品溶液，懸掛在清水容器中。經(jīng)常更換清水使透析膜內(nèi)外溶液的濃度差加大，必要時(shí)適當(dāng)加熱，并加以攪拌，以利透析速度加快。為了加快透析速度，還可應(yīng)用電透析法，即在半在半透膜旁邊純?nèi)軇﹥啥?/p>

放置二個(gè)電極，接通電路，則透析膜中的帶有正電荷的成分如無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、生物堿等向陰極移動(dòng)，而帶負(fù)電共荷的成分如無(wú)機(jī)陰離子、有機(jī)酸等則向陽(yáng)極移動(dòng)，中性化合物及高分子化合物則留在透析膜中。透析是否完全，須取透析膜內(nèi)溶液進(jìn)行定性反應(yīng)檢查。

一般透析膜可以自制：動(dòng)物半透膜如豬、牛的膀胱膜、用水洗凈，再以乙醚脫脂，，即可供用；羊皮紙膜可將濾紙浸入50％的硫酸15～60分鐘，取出鋪在板上，以水沖洗制得。其膜孔大小與硫酸濃度、浸泡時(shí)間以及用水沖洗速度有關(guān)；火棉膠膜系將火棉膠溶于乙醚及無(wú)水乙醇，涂在板上，干后放置水中即可供用，其膜孔大小與溶劑種類、溶劑揮發(fā)速度有關(guān)，溶劑中加入適量水可使膜孔增大，加入少量醋酸可使膜孔縮?。坏鞍踪|(zhì)膠（明膠）膜可用20％明膠涂于細(xì)布上，陰干后放水中，再加甲醛使膜凝固，沖洗干凈即可供用。近來(lái)商品有透析膜管成品出售，國(guó)外習(xí)稱“ViskingDialysisTubing”，有各種大小厚度規(guī)格，可供不同大小分子量的多糖、多肽透析時(shí)選用。

（六）結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法：鑒定中草藥化學(xué)成分，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化臺(tái)物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行分離精制。一般他說(shuō)，中草藥化學(xué)成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都具有結(jié)晶他的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來(lái)達(dá)到分離精制的目的。研究中草藥化學(xué)成分時(shí)，一旦獲得結(jié)晶，就能有效地進(jìn)一步精制成為單體純品。純化臺(tái)物的結(jié)晶有一定的熔點(diǎn)和結(jié)晶學(xué)的特征，有利于鑒定。如果鑒定的物質(zhì)不是單體純品，不但不能得出正確的結(jié)論，還會(huì)造成工作上的浪費(fèi)。因此，求得結(jié)晶并制備成單體純品，就成為鑒定中草藥成分、研究其分子結(jié)構(gòu)重要的一步。

1．雜質(zhì)的除去：中草藥經(jīng)過(guò)提取分離所得到的成分，大多仍然含有雜質(zhì)，或者是混合成分。有時(shí)即使有少量或微量雜質(zhì)存在，也能阻礙或延緩結(jié)晶的形成。所以在制備結(jié)晶時(shí)，必須注意雜質(zhì)的干擾，應(yīng)力求盡可能除去。有時(shí)可選用溶劑溶出雜質(zhì)，或只溶出所需要的成分。有時(shí)可用少量活性炭等進(jìn)行脫色處理，以除去有色雜質(zhì)。有時(shí)可通過(guò)氧化鋁，硅膠或硅藻土短柱處理后，再進(jìn)行制備結(jié)晶。但應(yīng)用吸附劑除去雜質(zhì)時(shí)，要注意所需要的成分也可能被吸附而損失。此外，層析法更是分離制備單體純品所常用的有效方法。

如果一再處理仍未能使近于純品的成分結(jié)晶化，則可先制備其晶態(tài)的衍生物，再回收原物，可望得到結(jié)晶。例如游離生物堿可制備各種生物堿鹽類，羥基化合物可轉(zhuǎn)變成乙酸化物，碳基化臺(tái)物可制備成苯蹤衍生物結(jié)晶。美登堿在原料中含量少，且反復(fù)分離精制難以得到結(jié)晶，但制備成3一滇丙基美登堿結(jié)晶后，再經(jīng)水解除去澳丙基，美登堿就能制備成為結(jié)晶。

2．溶劑的選擇；制備結(jié)晶，要注意選擇合宜的溶劑和應(yīng)用適量的溶劑。合宜的溶劑，最好是在冷時(shí)對(duì)所需要的成分溶解度較小，而熱時(shí)溶解度較大。溶劑的沸點(diǎn)亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶劑中不易形成結(jié)晶，而在某些溶劑中則易于形成結(jié)晶。例如葛根素、逆沒食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成結(jié)晶，大黃素（emodin）在吡啶中易于結(jié)晶，萱草毒素（hemerocallin）在N，N一二甲基甲酞胺（DMF）中易得到結(jié)晶，而穿心蓮亞硫酸氫鈉加成物在丙酮一水中較易得到結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿通常為無(wú)定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成為加成物結(jié)晶。

3．結(jié)晶溶液的制備：制備結(jié)晶的溶液，需要成為過(guò)飽和的溶液。一般是應(yīng)用適量的溶劑在加溫的情況下，將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結(jié)晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴隨結(jié)晶析出更多的雜質(zhì)。

“新生態(tài)”的物質(zhì)即新游離的物質(zhì)或無(wú)定形的粉未狀物質(zhì)，遠(yuǎn)較晶體物質(zhì)的溶解度大，易于形成過(guò)飽和溶液。一般經(jīng)過(guò)精制的化合物，在蒸去溶劑抽松為無(wú)定形粉未時(shí)就是如此，有時(shí)只要加入少量溶劑，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出結(jié)晶。例如長(zhǎng)春花總?cè)鯄A部分抽松后加入1．5倍量的甲醇溶解，放置后很訣析出長(zhǎng)春堿結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿在乙醚中很難溶解，但當(dāng)其鹽的水溶液用氨液堿化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛堿的乙醚加成物結(jié)晶。

制備結(jié)晶溶液，除選用單一溶劑外，也常采用混合溶劑。一般是先將化合物溶于易溶的溶劑中，再在室溫下滴加適量的難溶的溶劑，直至溶液微呈渾濁，并將此溶液微微加溫，使溶液完全澄清后放置。例如J一細(xì)辛醚重結(jié)晶時(shí)，可先溶于乙醇，再滴加適量水，即可析出很好的結(jié)晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙時(shí)，在已精制飽和的水溶液上添加一層乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性雜質(zhì)，又可降低水的極性，促使虎杖俄的結(jié)晶化。自秦皮中提取七葉甙（秦皮甲素），也可運(yùn)用這樣的辦法。

結(jié)晶過(guò)程中，一般是溶液濃度高，降溫訣，析出結(jié)晶的速度也快結(jié)晶的顆粒較小，雜質(zhì)也可能多些。有時(shí)自溶液中析出的速度太快，超過(guò)化合物晶核的形成勸分子定向排列的速度，往往只能得到無(wú)定形粉未。有時(shí)溶液太濃，粘度大反而不易結(jié)晶化。如果溶液濃度適當(dāng)，溫度慢慢降低，有可能析出結(jié)晶較大而純度較高的結(jié)晶。有的化合物其結(jié)晶的形成需要較長(zhǎng)的時(shí)間，例如鈴蘭毒甙等，有時(shí)需放置數(shù)天或更長(zhǎng)的時(shí)間。

4．制備結(jié)晶操作：制備結(jié)晶除應(yīng)注意以上各點(diǎn)外，在放置過(guò)程中，最好先塞緊瓶塞，避免液面先出現(xiàn)結(jié)晶，而致結(jié)晶純度較低。如果放置一段時(shí)間后沒有結(jié)晶析出，可以加入極微量的種晶，即同種化合物結(jié)晶的微小顆粒。加種晶是誘導(dǎo)晶核形成常用而有效的手段。一般他說(shuō)，結(jié)晶化過(guò)程是有高度選擇性的，當(dāng)加入同種分子或離子，結(jié)晶多會(huì)立即長(zhǎng)大。而且溶液中如果是光學(xué)異構(gòu)體的混合物，還可依種晶性質(zhì)優(yōu)先析出其同種光學(xué)異構(gòu)體。沒有種晶時(shí)，可用玻璃棒蘸過(guò)飽和溶液一滴，在空氣中任溶劑揮散，再用以磨擦容器內(nèi)壁溶液邊緣處，以誘導(dǎo)結(jié)晶的形成。如仍無(wú)結(jié)晶析出，可打開瓶塞任溶液逐步揮散，慢慢析晶?；蛄磉x適當(dāng)溶劑處理，或再精制一次，盡可能除盡雜質(zhì)后進(jìn)行結(jié)晶操作。

5．重結(jié)晶及分步結(jié)晶：在制備結(jié)晶時(shí)，最好在形成一批結(jié)晶后，立即傾出上層溶液，然后再放置以得到第二批結(jié)晶。晶態(tài)物質(zhì)可以用溶劑溶解再次結(jié)晶精制。這種方法稱為重結(jié)晶法。結(jié)晶經(jīng)重結(jié)晶后所得各部分母液，再經(jīng)處理又可分別得到第二批、第三批結(jié)晶。這種方法則稱為分步結(jié)晶法或分級(jí)結(jié)晶法。晶態(tài)物質(zhì)在一再結(jié)晶過(guò)程中，結(jié)晶的析出總是越來(lái)越快，純度也越來(lái)越高。分步結(jié)晶法各部分所得結(jié)晶，其純度往往有較大的差異，但?？色@得一種以上的結(jié)晶成分，在未加檢查前不要貿(mào)然混在一起。

6．結(jié)晶純度的判定：化合物的結(jié)晶都有一定的結(jié)晶形狀、色澤熔距，一可以作為鑒定的初步依據(jù)。這是非結(jié)晶物質(zhì)所沒有的物理性質(zhì)?；衔锝Y(jié)晶的形狀和熔點(diǎn)往往因所用溶劑不同而有差異。原托品堿在氯仿中形成棱往狀結(jié)晶，熔點(diǎn)207℃；在丙酮中則形成半球狀結(jié)晶，熔點(diǎn)203℃；在氯仿和丙酮混合溶劑中則形成以上兩種晶形的結(jié)晶。又如N一氧化苦參堿，在無(wú)水丙酮中得到的結(jié)晶熔點(diǎn)208℃，在稀丙酮（含水）析出的結(jié)晶為77～80℃。所以文獻(xiàn)中常在化合物的晶形、熔點(diǎn)之后注明所用溶劑。一般單體純化合物結(jié)晶的熔距較窄，有時(shí)要求在0．5℃左右，如果熔距較長(zhǎng)則表示化合物不純。

但有些例外情況，特別是有些化合物的分解點(diǎn)不易看得清楚。也有的化合物熔點(diǎn)一致，熔距較窄，但不是單體。一些立體異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)非常類似的混合物，常有這樣的現(xiàn)象。還有些化合物具有雙熔點(diǎn)的特性，即在某一溫度已經(jīng)全部融熔，當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)又固化，再升溫至一定溫度又熔化或分解。如防己諾林堿在1760C時(shí)熔化，至200℃時(shí)又固化，再在2420C時(shí)分解。中草藥成分經(jīng)過(guò)同一溶劑進(jìn)行三次重結(jié)晶，其晶形及熔點(diǎn)一致，同時(shí)在薄層層析或紙層層析法經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)檢定，也為一個(gè)斑點(diǎn)者，一般可以認(rèn)為是一個(gè)單體化合物。但應(yīng)注意，有的化合物在一般層析條件下，雖然只呈現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，但并不一定是單體成分。例如鹿含草中主成分為高熊果砍，異高熊果甙極難用一般方法分離，經(jīng)反復(fù)結(jié)晶后，在紙層及聚酞胺薄層上都只有一個(gè)斑點(diǎn)，易誤認(rèn)為單一成分，但測(cè)其熔點(diǎn)在115～125℃，熔距很長(zhǎng)。經(jīng)制備其甲醚后，再經(jīng)紙層層析檢定，可以出現(xiàn)兩個(gè)斑點(diǎn)，異高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根莖揮發(fā)油中的α一細(xì)辛醚和β一細(xì)辛醚，在一般薄層上均為一個(gè)斑點(diǎn)，前者為結(jié)晶，熔點(diǎn)63℃，后者為液體沸點(diǎn)296℃，用硝酸銀薄層或氣相層忻很容易區(qū)分。有時(shí)個(gè)別化合物（如氨基酸）可能部分地與層析紙或薄層上的微量金屬離子（如Cu）、酸或堿形成絡(luò)合物、鹽或分解而產(chǎn)生復(fù)斑。因此，判定結(jié)晶純度時(shí)，要依據(jù)具體情況加以分析。此外，高壓液譜、氣相層析、紫外光譜等，均有助于檢識(shí)結(jié)晶樣品的純度。

C.層析法：

層析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，對(duì)于植物各類化學(xué)成分的分離鑒定工作起到重大的推動(dòng)作用。如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)除丹參酮Ⅰ為純品外，Ⅱ、Ⅲ、均為混合結(jié)晶。此后通過(guò)各種層析方法，迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體（其中有4種為我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)）。目前新的層析技術(shù)不斷發(fā)展，隨著層析理論和電子學(xué)、光學(xué)、計(jì)算機(jī)等技術(shù)的應(yīng)用，層析技術(shù)已日趨完善。

一．層析法的基本原理：

層析過(guò)程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)之差（分配層析），組分對(duì)吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大?。ㄅ抛鑼游觯┒蛛x。通常又將一般的以流動(dòng)相為氣體的稱為氣相層析，流動(dòng)相為液體的稱為液相層析。

一、吸附層析法（AdsorptionChromatography）

（一）吸附劑、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系：液一固吸附層析是運(yùn)用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個(gè)因素。

1． 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。

（1） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過(guò)氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過(guò)17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對(duì)硅膠的活化，當(dāng)硅膠加熱至100～110℃時(shí)，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當(dāng)溫度升高至500℃時(shí)，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺(tái)轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。

硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿注化臺(tái)物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。

（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對(duì)于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因?yàn)橛袝r(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內(nèi)徑與柱長(zhǎng)比例在1：10-20之向。

在用溶劑沖洗柱時(shí)，流速不宜過(guò)快，洗脫液的流速一般以每半～1小時(shí)內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。

（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻浚魹榛钚蕴考?xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕矣诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭的有為吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉?duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。

2．溶劑：層析過(guò)程中溶劑的選擇，對(duì)組分分離關(guān)系極大。在柱層析時(shí)所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時(shí)常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來(lái)加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時(shí)，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對(duì)某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。

在柱層操作時(shí)，被分離樣品在加樣時(shí)可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個(gè)十分緩慢的過(guò)程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個(gè)成分逐個(gè)被洗脫。如果極性增大過(guò)訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時(shí)可以用溶劑的介電常數(shù)（ε）來(lái)表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對(duì)非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強(qiáng)。

3．被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個(gè)要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個(gè)成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對(duì)極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強(qiáng)。

當(dāng)然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團(tuán)的數(shù)目愈多，被吸附的住能就會(huì)更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會(huì)強(qiáng)些。總之，只要兩個(gè)成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強(qiáng)度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來(lái)考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團(tuán)，則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般Ⅲ～Ⅳ級(jí)）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系。現(xiàn)以實(shí)例說(shuō)明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當(dāng)以硅膠為吸附劑時(shí)，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。

又如對(duì)于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來(lái)。這一例子說(shuō)明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時(shí)，需用不同的溶劑才能達(dá)到相同的分離效果，從而說(shuō)明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。

（二）簿層層析：薄層層析是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。

1．薄層層析的特點(diǎn)：薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。

2．吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細(xì)，一般應(yīng)小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過(guò)高，以Ⅱ～Ⅲ級(jí)為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細(xì)而定，薄層粒度越細(xì)，展開距離相應(yīng)縮短，一般不超過(guò)10厘米，否則可引起色譜擴(kuò)散影響分離效果。

3．展開劑的選擇：薄層層析，當(dāng)吸附劑活度為一定值時(shí)（如Ⅱ或Ⅲ級(jí)），對(duì)多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而分為無(wú)極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性。但在實(shí)際工作中，經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小，對(duì)展開劑的極性予以調(diào)整。

4·特殊薄層：針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時(shí)需采用一些特殊薄層。

① 熒光薄層：有些化合物本身無(wú)色，在紫外燈下也不顯熒光，又無(wú)適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí)，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無(wú)機(jī)物。其一是在254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬

② 絡(luò)合薄層：常用的有硝酸銀薄層，用來(lái)分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機(jī)理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物，而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上，化臺(tái)物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。此外，在一個(gè)雙鍵化臺(tái)物中，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此，還可用來(lái)分離順?lè)串悩?gòu)體。

③ 酸堿薄層和PH緩沖薄層：為了改變吸附劑原來(lái)的酸堿性，可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時(shí)對(duì)堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時(shí)，用稀堿溶液0.1～0．5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時(shí)，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）為展開劑Rf＜0．1，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0．4左右。說(shuō)明豬屎豆堿為--堿性生物堿。

5.應(yīng)用：薄層層析法在中草藥化學(xué)成分的研究中，主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。

用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件，有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。

以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定，最好要有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后，標(biāo)準(zhǔn)品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都完全相同，則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對(duì)。

用薄層層析法探索柱層分離條件，是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法。在進(jìn)行柱層分離時(shí)，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過(guò)程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。通過(guò)薄層的預(yù)分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對(duì)含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經(jīng)適當(dāng)改變，轉(zhuǎn)至一般往層所采用洗脫的方式進(jìn)行制備柱分離。利用薄層的預(yù)分離尋找柱層的洗脫條件時(shí),假定在薄層上所測(cè)得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由于在薄層展開時(shí)，薄層固定相中所含的溶劑經(jīng)過(guò)不斷的蒸發(fā)，而使薄層上各點(diǎn)位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴(yán)格控制層析操作條件，則可得到接近真實(shí)的Rf值。用薄層進(jìn)行某一組分的分離，其Rf值范圍，一般情形下為0．85＞Rf＞0．05。此外，薄層層析法亦應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查，對(duì)控制化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程，反應(yīng)副產(chǎn)品產(chǎn)物的檢查，中間體分析，化學(xué)藥品及制劑雜質(zhì)的檢查，臨床和生化檢驗(yàn)以及毒物分析等，都是有效的手段。

執(zhí)業(yè)藥師《中藥化學(xué)》輔導(dǎo)：中藥有效成分的分離與精制

醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)——執(zhí)業(yè)藥師考試輔導(dǎo)系列談之《中藥化學(xué)》輔導(dǎo)：中藥有效成分的分離與精制

（一）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

（1）結(jié)晶及重結(jié)晶方法

判斷結(jié)晶純度的方法有：

a.晶型均一，色澤均勻醫(yī)。學(xué)教育網(wǎng)原創(chuàng)。

b.有一定的熔點(diǎn)和較小的溶距，熔距應(yīng)在2℃以內(nèi)。

c.TLC或PC分別用三種以上溶劑系統(tǒng)檢識(shí)，呈現(xiàn)單一圓整斑點(diǎn)。

d.HPLC或GC檢查呈現(xiàn)單峰。

（2）沉淀法

水提醇沉法（除去多糖或蛋白質(zhì)）

醇提水沉法（除去樹脂或葉綠素）

醇提乙醚沉淀或丙酮沉淀法（使皂甙沉淀析出）

（3）pH法

酸提堿沉法（使生物堿類成分沉淀）

堿提酸沉法（使黃酮、蒽醌等成分沉淀）

等電點(diǎn)法（使蛋白質(zhì)沉淀）

（4）鹽類沉淀法：

（二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離

1.液-液萃取與分配系數(shù)K值

2.分離難易與分離因子β

3.分配比與pH醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)原創(chuàng)

4.紙色譜

5.分配柱色譜

（三）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離

1.物理吸附基本規(guī)律—相似者易于吸附

（1）對(duì)極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力。故極性強(qiáng)的溶質(zhì)將被優(yōu)先吸附。

（2）溶劑極性越弱，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附能力越強(qiáng)。溶劑極性增強(qiáng)，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附能力減弱。

（3）溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但加入極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被后者置換洗脫出來(lái)。

活性炭因?yàn)槭欠菢O性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反。

2.極性及其強(qiáng)弱判斷

（1）官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱按下列表達(dá)順序排列：

RCOOH ＞ Ar-OH ＞＞、RNHR ＞ RC=O ＞ R-O-R ＞ RH（2）化合物的極性由分子中所含官能團(tuán)決定。

3.吸附色譜法應(yīng)用

（1）硅膠、氧化鋁吸附柱色譜過(guò)程中，吸附劑的用量一般為樣品量的30-60倍。樣品極性較小、醫(yī)學(xué)教、育網(wǎng)原創(chuàng)難以分離者，吸附劑用量可適當(dāng)提高至樣品量的100-200倍。

（2）硅膠、氧化鋁吸附柱色譜，應(yīng)盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解樣品，以利于樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。

（3）洗脫所用溶劑的極性宜逐步增加。

（4）為避免發(fā)生化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠，堿性物質(zhì)則宜用氧化鋁進(jìn)行分離。

4.聚酰胺吸附色譜法

（1）聚酰胺的性質(zhì)及吸附原理

① 形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，吸附能力越強(qiáng)。

② 成鍵位置對(duì)吸附力也有影響。易形成分于內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附相對(duì)減弱。

③ 分子中芳香化程度高者，醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng)原創(chuàng)則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱。

一般情況下，各種溶劑在聚酸胺柱上的洗脫能力由弱至強(qiáng)，可大致排列成下列順序；水→甲醇→丙酮→氫氧化鈉水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液

（2）聚酰胺色譜的應(yīng)用

5.大孔吸附樹脂

（1）大孔吸附樹脂的吸附原理

大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩性原理相結(jié)合的分子材料。吸附性是由于范德華引力或產(chǎn)生氫鍵的結(jié)果，分子篩性是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定的。

（2）影響吸附的因素

大孔吸附樹脂本身的性質(zhì)、溶劑的性質(zhì)和化合物的性質(zhì)是影響吸附的3個(gè)重要因素。

（3）大孔吸附樹脂的應(yīng)用

苷與糖類的分離，生物堿的精制，多糖、黃酮、三萜類化合物的分離。

（4）洗脫液的選擇

洗脫液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。

（四）根據(jù)物質(zhì)分子大小進(jìn)行分離

物質(zhì)分子大小不同的化合物可用透析法、凝膠過(guò)濾法、超濾法、超速離心法等分離。

1.凝膠過(guò)濾法醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)原創(chuàng)

凝膠的種類：常用的有葡聚糖凝膠（Sepadex-G）以及羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex-LH-20）。

2.膜過(guò)濾法

膜過(guò)濾法主要包括滲透、反滲透、超濾、電滲析、透析、液膜技術(shù)等。透析法多用于水溶性的大分子和小分子物質(zhì)的分離，如蛋白質(zhì)、酶、多糖分離過(guò)程中的脫鹽。醫(yī)學(xué)教育，網(wǎng)原創(chuàng)按照孔徑大小，可將透析膜分為：微濾膜、超濾膜、反滲透膜、納米膜。

（五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離

離子交換樹脂的種類：陽(yáng)離子（強(qiáng)酸型和弱酸型）交換樹脂和陰離子（強(qiáng)堿型和弱堿型）交換樹脂。

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