我國建立首株HCC-7721/VCR細胞系

我國建立首株HCC-7721/VCR細胞系

——比現(xiàn)有同類細胞系耐藥性有大幅提高

2006年01月19日 近日，空軍總醫(yī)院肝膽外科張希東主治醫(yī)師等在《第四軍醫(yī)大學學報》發(fā)表研究論文，報告他們采用長春新堿（VCR）大劑量間歇誘導(dǎo)法，首次在國內(nèi)成功建立一株具有耐藥細胞的基本生物學特性的耐長春新堿人肝癌細胞系HCC-7721/VCR。經(jīng)檢索，目前國內(nèi)尚無同類成果報道。這一研究成果，為學術(shù)界從分子水平研究肝癌細胞多藥耐藥（MDR）機制，建立了堅實的實驗基礎(chǔ)。

據(jù)介紹，臨床許多腫瘤患者在經(jīng)歷化療之后，腫瘤細胞對藥物產(chǎn)生多藥耐藥。目前認為，這種多藥耐藥性的產(chǎn)生，主要與以下機制有關(guān)：（1）發(fā)生在細胞膜水平的藥物攝取減少和外排增多，引起細胞內(nèi)藥物的絕對濃度降低；（2）發(fā)生在細胞質(zhì)和細胞器水平的藥物亞細胞分布改變，使藥物無法作用靶點；（3）藥物靶點的質(zhì)和量改變；（4）細胞解毒系統(tǒng)功能增強。但以上機制多見于血液系統(tǒng)腫瘤，對實體瘤的多藥耐藥則難以完全解釋。肝癌是化療敏感性最差的惡性實體瘤，它具有抗腫瘤藥物天然耐藥和化療中繼發(fā)性耐藥特性。因此，建立穩(wěn)定的肝癌細胞系，是研究肝癌特殊耐藥機制的前提和基礎(chǔ)。

近年來，研究人員采用長春新堿(抗腫瘤藥物)大劑量間歇誘導(dǎo)法，通過體外對肝癌HCC-7721細胞株的培養(yǎng)建模、倍增時間測定及藥物敏感試驗等程序和手段，成功建立起一株耐長春新堿人肝癌細胞系HCC-7721/VCR。該細胞系經(jīng)鑒定，HCC-7721/VCR細胞系較HCC-7721細胞株的長春新堿半數(shù)致死亡濃度(IC50)增大了4.15倍；對多種化療藥物如5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)、順鉑(CDDP)、阿霉素（ADB）均產(chǎn)生耐藥，其耐藥性提高了2~4倍。在生長曲線檢測中發(fā)現(xiàn)，HCC-7721/VCR細胞系的倍增時間為373小時，其耐藥倍增時間延長是HCC-7721細胞株的3.9倍。同時還發(fā)現(xiàn)，其細胞系增殖速度減慢與HCC-7721細胞株相比，有顯著性差異（P

據(jù)張希東介紹，研究腫瘤多藥耐藥機制是腫瘤治療領(lǐng)域的一個熱點課題，其前提——建立穩(wěn)定的耐藥細胞系已引起人們的極大關(guān)注。目前，體外誘導(dǎo)腫瘤耐藥細胞系的方法有兩種：一是大劑量藥物間歇誘導(dǎo)法；二是藥物濃度遞增法。研究表明，大劑量藥物間歇誘導(dǎo)法的給藥方式與臨床化療相似，誘導(dǎo)的耐藥細胞長期培養(yǎng)于無藥培養(yǎng)液中，仍保持穩(wěn)定的耐藥性及細胞生物學特性，這有利于耐藥細胞系在研究應(yīng)用中的穩(wěn)定性和可靠性。該研究建立的耐長春新堿人肝癌細胞系HCC-7721/VCR均具有上述特性，對于研究揭示肝癌細胞耐藥機制具有重要意義和應(yīng)用前景。

肝癌細胞的培養(yǎng)

SMMC-7721細胞系是于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細胞癌HCC患者的手術(shù)切除標本進行體外培養(yǎng)而得。其生物學特性如下: 細胞系生長較迅速穩(wěn)定，在原代細胞開始傳代階段增殖緩慢，以后趨于穩(wěn)定而迅速生長；細胞形態(tài)為上皮樣；貼壁生長；細胞的亞微結(jié)構(gòu)形態(tài)符合癌細胞的一般特征；甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)免疫熒光染色呈陽性；LDH同工酶譜的變化與肝癌細胞的一般特征一致；免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤率高，動物異種后瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片檢查，其組織形態(tài)和原手術(shù)切除標本類似。

Bel-7402于1974年建立，來源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標本，屬于HCC。生物學特性如下: 細胞增長迅速而恒定，6-7 d可傳代1次；細胞形態(tài)以多邊形上皮樣占絕大多數(shù)；貼壁生長；細胞染色體中有一大而長的近端著絲點染色體，出現(xiàn)頻率高，是本株細胞的標記染色體；AFP免疫熒光反應(yīng)陽性；LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性；異種接種后成瘤率高，3-4d可成瘤，瘤塊組織學病理與臨床HCC相近。

該細胞系由上海醫(yī)科大學中山醫(yī)院建立, 將一名我國39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)而得。已證實, 經(jīng)過再次分離得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33種細胞株，依據(jù)它們的轉(zhuǎn)移特點，雖來源同一父系，但具有異質(zhì)性，即具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。

MHCC97人肝癌細胞系于1998年從裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型(LCI-D20)體外傳代培養(yǎng)獲得，該細胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學和遺傳學特征，細胞呈上皮樣，貼壁生長，血清HBsAg、AFP高表達，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率100%，故證實該細胞系為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細胞系。

2001年，研究者從MHCC97細胞系中發(fā)現(xiàn)并分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個細胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率100%，后者40%；從生長速度上，前者細胞倍增時間較后者短；穿透人工基底膜能力前者較后者大；前者均較后者活力強、代謝旺。傳代至20代后，兩種形態(tài)學特征及生長速度方面均較穩(wěn)定。之后又從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細胞系。

1979年，從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細胞瘤中分離出并建立, 該細胞系呈上皮樣; 貼壁抱團生長; 生長較快, 傳代周期為1-2d; 低轉(zhuǎn)移; 裸鼠中成瘤率較差;AFP陽性; HBsAg陰性, 然而目前尚未證明該細胞中有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因組; 但通過實驗已證實, 該細胞系分化程度較高, 細胞里代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整, 不需加入外源性活化系統(tǒng)。在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定, 不會因傳代次數(shù)增多而有所改變, 所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實質(zhì)細胞同源, 因此, 常被用于體外肝細胞代謝或遺傳毒性試驗方面的理想細胞系. 其中, HepG2.2.15是目前應(yīng)用較為廣泛的細胞株, 它是HepG2的衍生物是體外篩選抗HBV藥物的良好模型, 并用于抗HBV新藥開發(fā)的體外研究工具。

Hep3B分離自8歲美國黑人男童的肝癌組織. 細胞形態(tài)跟HepG2類似, 呈上皮細胞, 電鏡下觀察胞漿里面很多粗大的黑顆粒, 同樣喜抱團貼壁生長; 其在裸鼠中能致瘤, 但基本不轉(zhuǎn)移. HBV陽性, 這與HepG2不同, 這株細胞整合了完整的HBV基因組，可用于HBV感染后發(fā)展致癌相關(guān)研究。

該細胞系于1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標本上培養(yǎng)而得。該細胞AFP陽性，高度分化, 細胞呈上皮樣, 貼壁生長. 特點是HBV陰性, 而具有丙型肝炎病毒(hepatitisC virus, HCV)易感性，故可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究. 除了用于研究致癌性, 還用于基因表達的調(diào)節(jié)機制、新陳代謝及VLDL的分泌等. 此細胞系的特別之處如下: 可用于生產(chǎn)重組蛋白如促紅細胞生成素; 在蛋白質(zhì)生物學方面用于研究在肝細胞內(nèi)復(fù)制的登革病毒; 廣泛用于異種移植動物模型.

PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細胞于1976年建系, 細胞來自一位患有原發(fā)性HCC的莫桑比克男性患者的標本; 為上皮樣貼壁生長; AFP陽性, 不產(chǎn)生白蛋白; 分泌ad亞型的HBsAg而不產(chǎn)生HBcAg或HBeAg和Dane顆粒, 卻可維持HAV的繁殖; 該細胞可能含有全部HBV基因組, 同工酶譜及核型與人類同源;裸鼠異種移植可致瘤. 此細胞系因其產(chǎn)生HBsAg的物理化學和免疫化學特性跟HBV攜帶者血清中HBsAg相似, 因此, 可被用來研究HBV體外病毒及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián), 抗HBV疫苗所需的HBsAg顆粒的制備及抗病毒藥物的制備等方面。

首先，在選擇實驗對象的比較上，人肝癌細胞系相較于人原代肝細胞，克服了人原代肝細胞來源困難、實驗難控制、存活時間短的局限，肝癌細胞系為已獲得的穩(wěn)定傳代的細胞，具有來源方便、操作簡單、條件可控和可重復(fù)等優(yōu)點，是用于肝癌疾病相關(guān)研究的理想對象。

其次，肝癌細胞系均選擇來源于確診肝癌患者的病理組織，具有與肝癌患者體內(nèi)相似的遺傳基因組，其發(fā)生發(fā)展機制、功能蛋白表達、病毒復(fù)制能力、侵襲轉(zhuǎn)移功能及抗藥性等，具有與人類親源體極其相近的特點，因此更適合應(yīng)用于肝癌各領(lǐng)域的研究.

HepG2人肝腫瘤細胞株廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學及病毒 培養(yǎng) 等方面的研究,研究肝臟疾病發(fā)病機理及其臨床應(yīng)用有著重要意義。由于其與肝細胞具有相同的生物學活性，還被用于胰島素抵抗的研究。本文對肝癌 細胞培養(yǎng) 的最佳條件做一簡單綜述。

1.HepG2細胞的復(fù)蘇條件

1.1 復(fù)蘇溫度的選擇

唐孟萱等采用下述方法進行細胞復(fù)蘇：快速將所凍存細胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖 恒溫2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛 血清DMEM培養(yǎng)基,混勻后加入細胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5%CO2溫箱 37℃培養(yǎng)。唐孟萱等將上述方法與細胞專著所述方法相比較，傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細胞存活率為 68.4%，先40℃溶解后37℃恒溫方法復(fù)蘇后細胞存活率為85.7%。證明其所用方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇

鐘志宏等使用培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對HepG2細胞進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞結(jié)果在接種密度為1×104/cm2、血清含量為15%時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞開始貼壁，12h后大部分細胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。

而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞在接種密度為1×104/cm2、血清含量為20%時，時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞貼壁不明顯，但12h后部分細胞貼壁，24h后亦大部分細胞貼壁，且增值速度相對較慢，5天后可以按1:3的比例進行傳代。以上結(jié)果說明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細胞貼壁所用時間短、增殖速度快，并且傳代細胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來的麻煩，因此在HepG2細胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。

1.3 復(fù)蘇時的接種密度

甘起霓等研究發(fā)現(xiàn)當接種密度為1×104/cm2，血清含量為20%時, 細胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當接種密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%時, 細胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進行性退化; 當接種密度小于1×104/ cm2 血清含量為20%時, 細胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。

2.消化酶及消化時間的選擇

唐孟萱等研究發(fā)現(xiàn)， EDTA +胰酶的消化能力太強，消化時間不好把握，傳代消化后細胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時間太長且不易將細胞消化完全;用PBS將細胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min， 顯微鏡 下可觀察到細胞消化適度。鐘志宏等將待傳代細胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰 蛋白酶 溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化（消化液用量為蓋滿瓶底），觀察時間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細胞仍然消化不完全。

用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能完全消化好細胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化時，完全消化好細胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。根據(jù)上述結(jié)果可知，在進行HepG2細胞的消化時，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。費洪新[5]等人則推薦使用如下方法進行消化：果明顯，對細胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。

3.培養(yǎng)基中血清濃度的選擇

由于人肝癌 細胞株生長緩慢，惡性程度較高，對于血清的要求比較嚴格，其培養(yǎng)時所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細胞高一些。些經(jīng)驗，費洪新等人認為在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中HepG2人肝癌細胞生長迅速。鐘志宏、王爽等人的實驗結(jié)果也支持上述結(jié)果。甘起霓則認為血清含量為20%時, HepG2細胞貼壁后增殖速度最快。當HepG2細胞增殖數(shù)代后, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時, 可將血清含量逐漸降至10%。唐孟萱[1]等人則認為12%的血清濃度足以滿足HepG2細胞的生長。

4.雙抗?jié)舛鹊倪x擇

王爽等通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，雙抗?jié)舛葹?.5%時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長。

5.培養(yǎng)基pH條件的選擇

鐘志宏等人實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇細胞和傳代細胞在pH6.8-7.4、5%CO2條件下培養(yǎng)，其貼壁和增值速度無明顯變化。

而無CO2條件下培養(yǎng)時，復(fù)蘇細胞在不同pH值條件下均表現(xiàn)為培養(yǎng)液逐漸變堿性，細胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細胞在不同pH值條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)液逐漸變酸性,當pH值﹥7.0時，經(jīng)24h培養(yǎng)后，細胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養(yǎng)后大部分細胞已伸出偽足，細胞數(shù)量明顯增多；當pH值﹤7.0時，細胞貼壁困難，經(jīng)72h培養(yǎng)后，細胞縮小、呈退化趨勢。王爽等通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，pH7.2時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長，與上述結(jié)果相符。

6.細胞傳代條件的選擇

王爽等通過正交實驗對HepG2細胞的傳代條件進行優(yōu)選，他推薦在細胞匯合度達95%-1000%時進行傳代。

唐孟萱等人的研究結(jié)果表明HepG2 細胞生長至匯合度50%～95%時是對數(shù)生長期,死細胞相對較少;而當匯合度達到 100%時 ,生長趨于平臺期 ,死細胞數(shù)開始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續(xù)培養(yǎng),死細胞數(shù)明顯增加而活細胞數(shù)減少。據(jù)此可確定 HepG2 細胞培養(yǎng)最佳的傳代時期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實驗結(jié)果相符，推薦在匯合度在95%-100%時進行細胞傳代。

同為人肝癌細胞系，HepG2和SMMC-7721細胞的區(qū)別是什么

huh7細胞系的特點：在密度低的時候，是多邊形，密度大的時候，偏向于梭形。 Huh7是指人肝癌細胞系，是由Naka-bayashi等人建立的，細胞源自一個日本男性高分化肝細胞肝癌，HBV陰性，能產(chǎn)生一些細胞質(zhì)蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶、AFP等。

肝癌(liver cancer)是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘Ｕf的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌（primary carcinoma of liver)是指發(fā)生在肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的癌腫，該疾病是目前我國第四位的常見惡性腫瘤及第三位的腫瘤致死病因，嚴重威脅我國人民的生命和健康。原發(fā)性肝癌主要包括肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管（Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC）和 HCC-ICC 混合型三種不同病理類型，三者在發(fā)病機制、生物學行為、組織學形態(tài)、治療方法以及預(yù)后等方面差異較大，其中肝細胞癌占到 85%-90%以上，因此本章中的“肝癌”指肝細胞癌。本病惡性程度高，浸潤和轉(zhuǎn)移性強，遠期療效取決于能否早期診斷及早期治療，甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP)和影像學檢查相結(jié)合是早期診斷的主要輔助手段。

急求急性淋巴性白血病的問題

最好去做個檢查，但病人的心理作用還需要家里人的不斷關(guān)心，祝他早日恢復(fù)健康。

急性白血病

【概述】

急性白血病是一種或多種造血干細胞及祖細胞惡變，失去正常的增殖、分化及成熟能力，無控制的持續(xù)增殖，逐步取代骨髓并經(jīng)血液侵潤至全身組織及器官。

【診斷】

一、病史及癥狀

⑴病史提問：注意：①起病情況。②是否接觸放射線、化學物質(zhì)：如苯及其衍生物。③是否應(yīng)用過瘤可寧、馬法蘭、氮芥等烷化劑。④是否患有Bloom綜合征、Fanconi貧血及Down綜合征等疾病。

⑵臨床癥狀：一般貧血癥狀，鼻衄、牙齦出血或消化道出血，發(fā)熱，骨痛、關(guān)節(jié)痛，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累可出現(xiàn)頭疼、惡心、嘔吐、抽搐、大小便失盡，甚至昏迷。

二、體檢發(fā)現(xiàn)

貧血外貌，皮膚可見瘀點、瘀斑，牙齦滲血或伴牙齦增生，淋巴結(jié)腫大，胸骨中下段壓痛，肝脾輕、中度腫大。

三、輔助檢查

血象：血紅蛋白、血小板進行性減少，白細胞計數(shù)可增高或減少，分類可見原始或幼稚細胞。

骨髓象：增生活躍至極度活躍，可伴骨髓纖維化或骨髓壞死。按增生細胞的系列不同，分為急性非淋巴細胞白血?。ˋNLL）及急性淋巴細胞白血病（ALL）。其骨髓特點如下：

⑴ ANLL ： ① M1型（急性粒細胞白血病未分化型）：原粒細胞≥90％（非紅系細胞），早幼粒細胞少見，中幼粒細胞以下階段不見或罕見；可見Auer小體。紅系、巨核細胞系增生受抑。

② M2型（急性粒細胞白血病部分分化型）：粒系明顯增生，可見Auer小體；紅系、巨核細胞系增生受抑。根據(jù)粒細胞分化程度不同又分為：M2a型：原粒細胞30％～90％（非紅系細胞），單核細胞＜20％，早幼粒細胞以下階段>10％。 M2b型：原始及早幼粒細胞明顯增多，但以異常的中性中幼粒細胞增生為主，其胞核常有核仁，核漿發(fā)育明顯不平衡，此類細胞>30％。

③ M3型（急性顆粒增多的早幼粒細胞白血?。阂灶w粒增多的異常早幼粒細胞增生為主，此類細胞>30％（非紅系細胞）；易見Auer小體；紅系、巨核細胞系增生受抑。根據(jù)粒細胞分化程度不同又分為：M3a型（粗顆粒型）：嗜苯胺藍顆粒粗大，密集或融合。M3b型（細顆粒型）：嗜苯胺藍顆粒密集而細小。

④ M4型（急性粒－單核細胞白血?。毫Ｏ?、單核細胞系增生，紅系、巨核細胞系增生受抑。根據(jù)粒系、單核細胞系形態(tài)不同，又分四種類型：M4a：原始和早幼粒細胞增生為主，單核細胞系≥20％（非紅系細胞）。M4b：原、幼單核細胞增生為主，原粒和早幼粒細胞>20％（非紅系細胞）。M4c：原始細胞即具粒細胞系，又具單核細胞系形態(tài)特征者>30％（非紅系細胞）。M4Eo：除具上述特點外，還有粗大而圓的嗜酸顆粒及著色較深的嗜堿顆粒，占5％～30％（非紅系細胞）。

⑤M5型（急性單核細胞白血?。簡魏思毎翟錾梢娂毿uer小體；紅系、粒系及巨核細胞系增生受抑。根據(jù)單核細胞分化程度不同又分為：M5a型（未分化型）：原始單核細胞≥80％（非紅系細胞）。M5b型（部分分化型）：原始、幼稚>30％，原始單核細胞＜80％（非紅系細胞）。

⑥M6型（紅白血?。杭t細胞系>50％，且有形態(tài)學異常，非紅細胞系原粒細胞（或原始＋幼稚單核細胞>30％（非紅系細胞）；若血片中原粒細胞或原單核細胞>5％，骨髓非紅系細胞中原粒細胞或原始＋幼稚單核細胞>20％。巨核細胞減少。

⑦M7型（急性巨核細胞白血?。涸藓思毎?gt;30％。紅系、粒系增生相對抑制。

⑵ALL ： ① L1型：原始和幼稚淋巴細胞明顯增生，比例增高，以小淋巴細胞為主；核圓形，偶有凹陷與折疊，染色質(zhì)較粗，結(jié)構(gòu)較一致核仁少，不清楚；胞漿少，輕或中度嗜堿。

②L2型：原始和幼稚淋巴細胞明顯增生，比例增高，淋巴細胞大小不一，以大細胞為主；核形不規(guī)則，凹陷與折疊易見，染色質(zhì)較疏松，結(jié)構(gòu)不一致，核仁較清楚，一個或多個；胞漿量較多，輕或中度嗜堿。

③L3型：原始和幼稚淋巴細胞明顯增生，比例增高，但細胞大小較一致，以大細胞為主；核形較規(guī)則，染色質(zhì)呈均勻細點狀，核仁一個或多個，較明顯，呈小泡狀；胞漿量多，深藍色，空泡常明顯，呈蜂窩狀。

細胞化學染色：

⑴過氧化物酶及蘇丹黑染色：急淋細胞呈陰性（陽性＜3％）；急粒細胞呈強陽性；急單細胞呈陽性或弱陽性。

⑵糖原染色：急淋細胞呈陽性（粗顆粒或粗塊狀，常集于胞漿一側(cè)）；急粒、急單細胞呈弱陽性（彌散性細顆粒狀）；紅白血?。河准t細胞呈強陽性。

⑶非特異性酯酶染色：急單細胞呈強陽性，能被氟化鈉明顯抑制（>50％）；急粒細胞呈陽性或弱陽性，氟化鈉輕度抑制（＜50％）；急淋細胞一般呈陰性。

⑷中性粒細胞堿性磷酸酶染色：急淋白血病積分增高或正常；急粒白血病明顯減低；急單白血病可增高或減低。

有條件應(yīng)做免疫學、細胞遺傳學及基因分型。

四、鑒別診斷

應(yīng)與再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、傳染性單核細胞增多癥、原發(fā)性血小板減少性紫癜及類白血病反應(yīng)等病鑒別。

【治療措施】

1.治療原則：總的治療原則是消滅白血病細胞群體和控制白血病細胞的大量增生，解除因白血病細胞浸潤而引起的各種臨床表現(xiàn)。

2.支持治療

（1）注意休息：高熱、嚴重貧血或有明顯出血時，應(yīng)臥床休息。進食高熱量、高蛋白食物，維持水、電解質(zhì)平衡。

（2）感染的防治：嚴重的感染是主要的死亡原因，因此防治感染甚為重要。病區(qū)中應(yīng)設(shè)置“無菌”病室或區(qū)域，以便將中性粒細胞計數(shù)低或進行化療的人隔離。注意口腔、鼻咽部、肛門周圍皮膚衛(wèi)生，防止粘膜潰瘍、糜爛、出血，一旦出現(xiàn)要及時地對癥處理。食物和食具應(yīng)先滅菌?？诜晃盏目股厝鐟c大毒素、粘菌素和抗霉菌如制霉菌素、萬古霉素等以殺滅或減少腸道的細菌和霉菌。對已存在感染的患者，治療前作細菌培養(yǎng)及藥敏試驗，以便選擇有效抗生素治療。一般說來，真菌感染可用制霉菌素、克霉唑、咪康唑等；病毒感染可選擇Ara-c、病毒唑。粒細減少引起感染時可給予白細胞、血漿靜脈輸入以對癥治療。

(3)糾正貧血：顯著貧血者可酌情輸注紅細胞或新鮮全血；自身免疫性貧血可用腎上腺皮質(zhì)激素，丙酸睪丸酮或蛋白同化激素等。

(4)控制出血：對白血病采取化療，使該病得到緩解是糾正出血最有效的方法。但化療緩解前易發(fā)生血小板減少而出血，可口服安絡(luò)血預(yù)防之。有嚴重的出血時可用腎上腺皮質(zhì)激素，輸全血或血小板。急性白血病(尤其是早粒)，易并發(fā)DIC，一經(jīng)確診要迅速用肝素治療，當DIC合并纖維蛋白溶解時，在肝素治療的同時，給予抗纖維蛋白溶解藥(如對羧基芐胺、止血芳酸等)。必要時可輸注新鮮血或血漿。

(5)高尿酸血癥的防治：對白細胞計數(shù)很高的病人在進行化療時，可因大量白細胞被破壞、分解，使血尿酸增高，有時引起尿路被尿酸結(jié)石所梗阻，所以要特別注意尿量，并查尿沉渣和測定尿酸濃度，在治療上除鼓勵病人多飲水外，要給予嘌呤醇10mg／kg·d，分三次口服，連續(xù)5～6天；當血尿酸＞59um01／L時需要大量輸液和堿化尿液。

3.化學治療：化療是治療急性白血病的主要手段，可分為緩解誘導(dǎo)和維持治療兩個階段，其間可增加強化治療、鞏固治療和中樞神經(jīng)預(yù)防治療等。緩解誘導(dǎo)是大劑量多種藥物聯(lián)用的強烈化療，以求迅速大量殺傷白血病細胞，控制病情，達到完全緩解，為以后的治療打好基礎(chǔ)。所謂完全緩解，是指白血病的癥狀，體征完全消失，血象和骨髓象基本上恢復(fù)正常，急性白血病末治療時，體內(nèi)白血病細胞的數(shù)量估計為5×1010～13；，經(jīng)治療而達到緩解標準時體內(nèi)仍有相當數(shù)量的白血病細胞，估計在108～109以下，且在髓外某些隱蔽之處仍可有白血病細胞的浸潤。維持治療量一系列的小劑量較緩和的治療方案進行較長時間的延續(xù)治療，目的在于鞏固由緩解誘導(dǎo)所獲得的完全緩解，并使病人長期地維持這種“無病”狀態(tài)而生存，最后達到治愈。鞏固治療是在維持治療以后。維持治療以前，在病人許可的情況，再重復(fù)緩解誘導(dǎo)方案。強化治療是在維持治療的幾個療程中間再重復(fù)原緩解誘導(dǎo)的方案。中樞神經(jīng)預(yù)防性治療宜在誘導(dǎo)治療出現(xiàn)緩解后立即進行，以避免和減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)生，一個完整的治療方案應(yīng)遵循上述原則進行。

(1)急性淋巴細胞白血病的治療

①緩解誘導(dǎo)治療：治療ALL常用的化療方案是VP方案，以VP方案為基礎(chǔ)再與DRN(柔紅霉素)，ADM(阿霉素)，Ara-c，L-ASP(左旋門冬酰胺酶)和6-MP等藥物組成許多有效的多藥聯(lián)用方案。兒童初治病例CR(完全緩解)率可達90％～95％；成人亦可達80％～90％。多藥聯(lián)用方案主要用于難治和復(fù)發(fā)病例的治療，常用方案見表。

表 急性淋巴細胞白血病的緩解誘導(dǎo)方案

化療方案 劑量 用藥方法
VP方案 VCR 2mg 靜注，第1天 每周一次
PDN 60mg 分次口服，第1－7天
DVP方案 DRN 1mg/kg 靜注，第1天，每周1次 4～6周為一療程
VCR 1.5mg/m2 靜注，第1天，每周一次
PDN 40mg/m2 口服，第1～8天
POMP方案 PDN 60mg/d 分次口服 5天為一療程
VCR 2mg 靜注，第1天
MTX 30mg 靜注，第2、5天
6-MP 100mg 口服
VDCP方案 DRN 40mg/m2·d 靜注，第1、2、3、15、16、17天 三周為一療程
VCR 2mg 靜注，第1、8、15、21天
CTX 0.4-0.8/m2 靜注，第1、15天
PDN 40-60mg/m2·d 口服，第1－14天后，減量
DVP+ASP方案 VCR 2mg 靜注，第1天，每周1次 第15天作骨髓檢查，如仍有白血病細胞再用DRN50mg/m2，4周為一療程
DRN 50mg/m2 靜注，第1、2、3天
PDN 60mg/m2 分次口服，第1－28天
L-ASP 600u/m2 靜注，第17－28天

注：VP、DVP方案適用于兒童病例。

②維持治療：凡用上述方案達到CR后，應(yīng)繼續(xù)用原方案鞏固療效。用VP和VDP方案者，應(yīng)再繼續(xù)2～3周；用POMP方案者可再用兩個療程。緩解期間用6-MPl00mg／d，連續(xù)口服7天，繼之給CTX400mg靜注；間歇7天再給MTXl5mg，靜注或口服，第1、5、9天；間歇3天后依次重復(fù)上述治療。

③復(fù)發(fā)的治療：可繼續(xù)使用VP方案或Ara-C5-10mg，每日1次靜注，共4次，或DRNlmg／kg·d，靜注，共4天。

(2)急性非淋巴細胞性白血病的治療

①緩解誘導(dǎo)：治療方案見表30-3。

化療方案 劑量 用藥方法
DA方案 DRN 30～40mg/M2·d 靜注，第1～3天 間隔1～2周重復(fù)
Arc-c 100～160mg/M2 分次口服，第1～7天
VPP方案 VCR 2mg 靜注，第1天 間隔1～2周重復(fù)治療
Ara-C 100～150mg 靜注，第1、5天
DRN 30mg 靜注，第1、2天
COAP方案 CTX 200mg 靜注，第1、3、5天 每隔1周重復(fù)治療
VCR 2mg 靜注，第1天
Ara-c 100～150mg 靜滴，共4天
PDN 200mg/d 分次口服
HOP方案 VCR 2mg 靜注，第1天 間隔1～2周重復(fù)
HRT 2～4mg 靜滴，3小時滴完；第2、7天
PDN 40mg/d 分次口服，第1～8天

注：VPP方案可以ADM代之DRN，劑量為20mg同，靜注，第1、2天

②維持治療：一般以MTXl5mg肌注或口服，6-MPl00mg／d，CTX200mg／m2口服，每周1次，長期維持，并在維持治療開始后的l／2、1、2、4、7、16個月加用原誘導(dǎo)方案鞏固、強化，16個月后每半年1次，至少2～4年。

(3)小兒ALL治療方案

①緩解誘導(dǎo)：(VP方案及變換) 1)VCR2．0mg／m2／周，連用4周。2)PDN60mg／m2／日。3)或者加ADM20mg／m2，第14、15天。

②中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病預(yù)防治療：MTXl2mg／m2(大劑量：30mg／m2)鞘內(nèi)注射，每2周一次，連用3周；另外加用24Gy(2400rad)頭蓋照射。

③緩解期維持治療：

方案l——⑥6-MP75mg／m2，連續(xù)口服。⑥VCR2．0mg／m2第l天每4周l周期。①PDNl20mg／m2／d連用5天

方案2——＠MTXl50mg／m2靜注，每2周與下述之藥交替。⑥VCR2．0mg／m2l天。②PDN120mg／m2／d連用5天，每2周與MTX交替。①6-MPl00mg／m2／d×5天方案3——⑧MTXl75～225mg／m2靜注，每2周與下述之藥交替。⑥VCR2．0mg／m2第1天，每2周與MTX交替。②PDN120mg／m2／d連用5天。①6-MPl25～175mg／m2／d×5天。

(4)小兒ANLL的化療

VAPA方案是一種多藥強化的序貫式綜合治療程序，經(jīng)歷14個月的治療，不包括有CNS預(yù)防治療，對小兒ANLL治療效果，尤其是長時期的緩解確有較大改善，VAPA方案組織及用法如下：

治療程序Ⅰ——ADM45mg／m2／日，靜脈注射，第1天5Ara-C200mg／m2／日，靜脈注射，第1～5天。上藥每3～4周為1周期，共4個周期。

治療程序Ⅱ——ADM30mg／m2／日，靜脈注射，第1天；Ara-C150mg／m2／日，靜脈注射，第l～5天；上藥每4周為一周期，共4個周期。

治療程序Ⅲ——vcRl．5mg／m2／d靜脈注射，第l天；Me-PDN800mg／m2／日，靜脈注射，第l～5天；

6－MP500mg／m2／日，靜脈注射，第1～5天；MTX7．5mg／m2／日，靜脈注射，第1～5天；上藥每3周為一周期，共4個周期。

治療程序Ⅳ——Ara-C200mg／m2／日，靜脈注射，第l～5天，每3～4周為一周期，共4個周期。

4．中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白血病的防治

CNS白血病和腦膜白血病都可治療，首選藥物以MTX做鞘內(nèi)注射，但多數(shù)預(yù)后不佳，因此要強調(diào)CNS的預(yù)防治療。一般是MTX0．25～0．5mg／kg／次或42mg／m2／次(極量20．0mg)鞘內(nèi)注射直至癥狀緩解。其后再于6～8周間以同藥同劑量鞘內(nèi)注射以防止復(fù)發(fā)。亦可放射治療，如60Co顱腦照射，脊髓照射。

5．放射治療

(1)脾臟照射：脾腫大，疼痛，不能手術(shù)者。照射量1000～2000cGy／3～10次，3至12天。

(2)硬膜外浸潤壓迫脊髓：照射野上下均超出病灶區(qū)2個椎體，照射量為300～400cGy／次，照射3次后，改為200cGy／次，照射15次。

(3)中樞神經(jīng)系統(tǒng)照射：主要用于病部白細胞計數(shù)增高，T細胞型，血小板減少，淋巴結(jié)及脾臟腫大明顯者。①預(yù)防性照射，經(jīng)化療癥狀緩解后開始照射，全顱采用兩側(cè)野對穿照射，照射量為1800～2200cGy。②治療性照射：聯(lián)合化療，全顱照射1800cGy。③復(fù)發(fā)治療：行中樞性照射，顱部2000～2500cGy，骨髓1000～1250cGy。

(4)全射量髓消除：800cGy／次，用3天。

另外，對髓外局部病灶可局部照射，非姑息治療。放療應(yīng)聯(lián)合使用大劑量腎上腺皮質(zhì)激素，也可同時使用MTX＋Ara-C+氫化考的松椎管內(nèi)注射。

6．免疫治療：本病雖行長時間的鞏固強化治療，但體內(nèi)仍殘留一定數(shù)量的白血病細胞，用化療不能達到將其徹底消滅的目的，依靠人體的免疫可能消滅這些殘留的白血病細胞。近年來，免疫治療已逐漸被臨床應(yīng)用，常用的藥物有BCG、TF、IFN等。

7．骨髓移植，對ANLL療效較好。①同基因骨髓移植，供者為同卵孿生子。②同種異基因骨髓移植，供者為患者的兄弟姐妹。③自體骨髓移植，不需選擇供者，易推廣。

【臨床表現(xiàn)】

起病急驟，約66％的病人在一個月內(nèi)起病，病情急，發(fā)展快。貧血是常見又早期出現(xiàn)的癥狀，為嚴重的進行性貧血，出現(xiàn)皮膚蒼白、頭暈乏力、浮腫及活動后氣促等。以發(fā)熱為首發(fā)癥狀者占50％～84％，熱型不定。有兩種情況：①白血病本身發(fā)熱；由于白細胞轉(zhuǎn)換率增加及核蛋白代謝亢進造成低熱，一般不超過38．0℃，抗生素治療無效。②感染：由于白血病患者成熟細胞缺乏，身體免疫力降低，常導(dǎo)致各種感染，體溫可高達39～41℃，是引起死亡的主要原因。常見感染有上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎、口腔炎、疼痛、肺炎、泌尿系感染以及敗血癥等，以口腔炎最多見。由于血小板減少及血管受異常幼稚細胞浸潤常致出血。在成年人早期有出血癥狀者占急性白血病的38．6％；中晚期約50％～80％發(fā)生出血，其中約10％～15％的病人死于出血。發(fā)熱可加重或誘發(fā)出血。

出血部位可遍及全身，以皮膚、齒齦、口腔及鼻粘膜出血最常見，其次為胃腸道、泌尿道、子宮和呼吸道出血。早幼粒病人出血可發(fā)生在顱內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下腔與硬腦膜下，往往病情嚴重。眼底出血常為顱內(nèi)出血的先兆。尚有異常幼稚白細胞浸潤癥狀：①肝、脾腫大最多見，尤以從L(急性淋巴細胞性白血病)顯著。②淋巴結(jié)腫大，發(fā)病率為45．5％，多局限于頸、腋下及腹股溝等處。全身淋巴結(jié)腫大以從ALL最為多見，初診時可達80％。縱隔淋巴結(jié)腫大以小兒ALL多見。③骨骼表現(xiàn)：多見于ALL，患者常有胸骨下端叩痛和壓痛，四肢關(guān)節(jié)酸痛或隱痛，嚴重者關(guān)節(jié)腫脹，部分病人可引起骨質(zhì)疏松、溶骨性破壞，甚至病理性骨折。AML(急性粒細胞性白血病)病人可見眶骨浸潤引起眼球突出、復(fù)視，甚至失明，稱為綠色瘤。④神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)：約有2％急性白血病初診時有腦膜白血病，如未進行中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病預(yù)防處理，則70％的ALL，20％～40％兒童及5％成人ANLL(急性非淋白血病)可發(fā)生腦膜白血病。白細胞侵及蛛網(wǎng)膜出現(xiàn)腦積水與顱內(nèi)高壓癥狀，如侵及蛛網(wǎng)膜或腦實質(zhì)的血管壁可發(fā)生局灶性或彌漫腦出血。⑤其他：皮膚、粘膜、睪丸、肺、消化道、心臟等部位受侵出現(xiàn)相應(yīng)的體征。

【輔助檢查】

血紅蛋白和血小板數(shù)減少。白細胞總數(shù)多少不一，一般在20．0～50．0×109/L，少數(shù)高于100×109或低于10．0×109/L。半數(shù)以上的病人周圍血象中見到大量(有時高達90％)異常原始白細胞。血細胞化學染色方法可確定急性白血病的類型，約45％的病例有染色體異常，其中包括單倍體、超二倍體和各種標記染色體。骨髓增生活躍，明顯活躍或極度活躍，以白血病細胞為主。骨髓中原始細胞＞6％為可疑，超過30％診斷較肯定，原始細胞+早(幼)細胞≥50％可確診。全骨髓中，紅系及巨核細胞高度減少。在血象和骨髓象不足以證實急性白血病時，可應(yīng)用淋巴結(jié)穿刺液涂片和特異性皮損印片檢查找到相應(yīng)的白血病細結(jié)合病理印片，有助于診斷。血液生化檢查：①末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TDT)：在ALL時活性增高，而在ANLL中無活性。②堿性磷酸酶(AKP)：在ALL時明顯，AML明顯降低。②乳酸脫氫酶(LDH)：ALL時明顯增高。另外血清尿酸濃度增高，尿內(nèi)尿酸排泄量增多，在用細胞毒藥物治療時更甚。

【預(yù)后】

未經(jīng)治療者的平均生存時間僅3個月左右，但經(jīng)現(xiàn)代化化療者，疾病可以緩解，生存時間明顯延長，甚至長期生存或治愈。決定療效的因素除治療方法直接影響治療結(jié)果外，還有白血病和患者一些內(nèi)在的因素。對預(yù)后不利的高危因素有：①年齡在l歲以下和9歲以上的兒童和成人，60歲以上的老人尤其差；②男孩比女孩差；③治療前后細胞計數(shù)在50～100×109/L以上；④FAB分型屬L2、L3、L4、L5、L6、L7；⑤淋巴細胞白血病免疫分型屬T細胞和B細胞；⑥可見到染色體異常，尤其是斷裂和易位，但t(8；21)例外；⑦治療前血小板計數(shù)＜20～50×104/L；⑧治療后白血病細胞減少緩慢，到達緩解需時間長或緩解時間短；⑨肝脾腫大較明顯或有CNS白血病者。

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