靶向蛋白酶：成功、失敗與前景（二）

鑒別和確認蛋白酶靶標

了解健康與病變中蛋白酶信號的一個關鍵是鑒別蛋白酶的內生底物，目前已經應用許多方法來達到這一目的，計算生物學、遺傳學和蛋白質組學的進展也為其提供了有力手段。例如，通過采用噬菌體展示庫、組合熒光底物庫或基于共價抑制劑的位置掃描庫，一旦確定蛋白酶的擴展底物特性，就可以在基因組范圍的基礎上獲得生物信息學知識，根據已確定的蛋白酶底物特性來發(fā)現潛在的底物。

底物搜索的遺傳途徑通常是采用經典的基因敲除動物模型、RNA干擾（RNAi）技術。在靶標確認中應用的另一種方法往往是動物模型與經典的蛋白酶基因敲除動物模型的結合。這種方法已經用于研究半胱氨酸組織蛋白酶在不同癌細胞模型（例如Rip1-Tag2實驗鼠胰島腫瘤模型）中的作用。

蛋白質組學這一工具非常適合于鑒定和確認潛在的蛋白酶靶標。一些蛋白酶底物最近已經用這種方法確定，包括MMP底物和顆粒酶B底物。

蛋白酶活性的調節(jié)

蛋白酶活性是在轉錄水平受不同表達調控的，在蛋白質水平受無活性酶原的激活和抑制劑及輔因子的結合調控。

活性調節(jié)的基本機制存在于大多數的蛋白酶中。潛在的蛋白酶原等待一個激活的信號，這種信號可能來自變構激活體或者其他的蛋白酶。一旦激活后，底物和抑制劑競爭與蛋白酶的結合。蛋白酶活性也受到輔因子的調控，蛋白質往往是以變構的方式可逆地與蛋白酶和/或抑制劑結合，影響其最終活性。蛋白酶活性的其他重要調控物是它們內生或外生的抑制劑。一種抑制劑可以抑制幾種蛋白酶，如所有金屬肽鏈內切酶（180種以上）的主要抑制劑僅由4種蛋白質組成：金屬蛋白酶的組織抑制劑1（TIMP1）、TIMP2、TIMP3和TIMP4。

迄今為止，在靶向蛋白酶信號的一些途徑中，對蛋白酶進行抑制的探索最為廣泛。除了直接阻滯靶標蛋白酶的活性外，蛋白酶抑制劑也阻滯下游蛋白酶的激活，或者與輔因子聯合影響蛋白酶的活性。

直接抑制

大分子 在血液凝固領域已經開發(fā)出一些以蛋白酶為靶標的新型大分子抑制劑。

第一個例子是水蛭素的衍生物，這是一種從醫(yī)用水蛭中提純的強力可逆的凝血酶抑制劑，被批準作為抗凝血劑供臨床應用。第二個是來自犬鉤口線蟲的重組線蟲類抗凝血劑蛋白（rNAP）。據報告，rNAP具有令人滿意的安全性，在一項IIa臨床試驗中，治療急性冠脈綜合征（ACS）患者，劑量達10克/千克體重時耐受性良好。

從大豆分離出來的Bowman-Birk抑制劑濃縮物是幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑的混合物，它主要具有糜蛋白酶抑制活性，也有一些胰島素的抑制活性，幾年前的II期臨床試驗已表明其治療口癌有肯定效果。

另一種大分子抑制劑是人源性抗體。雖然對以蛋白酶為靶標的抑制性抗體研究處于早期階段，但已有一些這類藥物處于臨床前和早期臨床開發(fā)中，包括尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）和組織蛋白酶B的抑制性抗體用于癌癥的治療，組織因子的抑制性抗體用于廣泛的血栓性疾病的治療，VIIIa因子抑制性抗體用于靜脈血栓癥的治療。

小分子

發(fā)現蛋白酶抑制藥物的主要成就仍然是在小分子抑制劑上。通常，將虛擬篩選、基于結構的篩選和化合物小型集中庫的篩選結合起來進行篩選。

開發(fā)可逆還是不可逆的抑制劑是發(fā)現蛋白酶藥物要考慮的重要因素之一。可逆的抑制劑，尤其是選擇性好的可逆抑制劑可能僅部分阻滯其他蛋白酶的活性。但不可逆的抑制劑，根據結合動力學不同，遲早會阻滯它能結合的所有蛋白酶。已開發(fā)的一些不可逆的抑制劑就存在這種選擇性問題。理想的抑制劑應是非共價的可逆抑制劑——通常能提供更好的選擇性，引起的副作用要比共價抑制劑少。不過，非共價抑制劑的設計要困難得多。迄今為止，已經開發(fā)出為數不多的非共價可逆抑制劑，有些已經上市，例如絲氨酸蛋白酶抑制劑阿加曲班(Argatroban)，有些則仍處于早期實驗階段。

生物利用度也是蛋白酶抑制劑最優(yōu)化的關鍵問題之一。對于在動物模型中可以觀察到良好的生物利用度，而在人體上則不能重復這一難題，解決的一個策略是設計能在體內轉換成活性代謝物的前體藥物，比如ACE抑制劑主要就是作為酯前體藥物設計的。

蛋白酶藥物設計的另一個考慮因素是，抑制劑是競爭性還是非競爭性的。除了第一種抗蛋白酶治療藥物肝素——血凝蛋白酶的一種變構間接抑制劑以外，目前應用或開發(fā)的所有其他蛋白酶抑制劑都是競爭性抑制劑。由于采用的活性實驗簡單，發(fā)現競爭性抑制劑通常較容易。但這種途徑也有缺陷，例如，競爭性抑制劑可以引起底物競爭的飽和，必須要應用相當高的藥物劑量，安全窗狹窄。

雖然開發(fā)要困難得多，但變構小分子抑制劑對拮抗許多蛋白酶可能有用。最近Sunesis制藥公司完成了一項突破，開發(fā)出第一種變構半胱天冬酶抑制劑。

上調蛋白酶

在一些情形中，上調蛋白酶的活性可能是必須的，要達到這一目的，策略之一是阻滯內生蛋白酶抑制劑的活性。美國伯納姆研究所的一個小組應用基于聚苯基脲架構的化合物來拮抗蛋白質的凋亡抑制劑（IAP），由于它能抑制半胱天冬酶的活性，因此能刺激癌細胞的凋亡。細胞培養(yǎng)的初期研究表明，其對癌細胞具有明顯的凋亡作用和很好的選擇性，包括能增強其他化療藥物的敏感性。此外，這類化合物在腫瘤異種移植物的實驗鼠模型中也有效，未顯示毒性。

阻滯內生蛋白酶抑制劑的另一條途徑是運用反義分子。Aegera Therapeutics公司最近宣稱，已開始AEG35156的I期臨床試驗——這是X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的第二代反義寡核苷酸抑制劑，能促進癌細胞凋亡。單克隆抗體也可能具有潛力，新上市的抗血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑1（PAI1）單克隆抗體33H1F7顯示，能將活性PAI1轉換成組織型纖溶酶原激活劑（tPA）的底物，從而促進實驗鼠腸系膜動脈模型的的溶栓治療。

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