8月16日,世界衛(wèi)生組織駐華代表貝漢衛(wèi)提醒,SARS可能重新暴發(fā),各國一刻也不能放松警惕。
他的觀點得到了中國衛(wèi)生機構(gòu)官員的認同。北京市衛(wèi)生局常務(wù)副局長、北京市SARS醫(yī)療救治指揮中心總指揮韓德民透露,目前,北京市正在研究制定應(yīng)急預(yù)案防止SARS卷土重來。衛(wèi)生部副部長朱慶生要求,只要一有疫情,24小時內(nèi)人員必須到位。
他們是在北京地壇醫(yī)院出席為中國最后兩名非典患者康復(fù)出院而舉行的儀式上說這番話的。
貝漢衛(wèi)今天證實,世界衛(wèi)生組織和中國政府組成的專家組正在廣東考察,尋找SARS病毒的宿主,時間持續(xù)一周多。地壇醫(yī)院專家郭利民解釋,“宿主”就是病毒寄生的地方,比如艾滋病毒的宿主來自一種非洲的猴子。
貝漢衛(wèi)說:“冠狀病毒到底從哪里來?它是如何傳給人類的?全世界的專家還都沒有找到答案。在這種沒有科學(xué)突破的情況下,SARS卷土重來時,我們很少有科學(xué)的武器,只有依靠醫(yī)務(wù)人員的發(fā)現(xiàn)和及時報告?!?/p>
在廣東考察的世界衛(wèi)生組織總部專家科曼蒂博士表示,目前SARS病毒的自然生態(tài)尚未可知,而掌握SARS病毒的自然生態(tài)是真正控制SARS疫病的關(guān)鍵,找不到SARS病毒的宿主,SARS疫病隨時都可能重新暴發(fā)流行。
韓德民說,大家關(guān)心“今冬明春非典是否再次發(fā)生”,這種情況是有可能的,北京已經(jīng)做好了準備。
韓德民說,北京正在制定“防止非典反彈和再度突發(fā)”的應(yīng)急預(yù)案。北京將形成“防治非典應(yīng)急網(wǎng)絡(luò)”。他說,北京已經(jīng)為可能再次出現(xiàn)非典疫情做好了充分的思想、組織和物質(zhì)準備,也有了具體措施。
衛(wèi)生部副部長朱慶生要求,首都防治非典工作仍要嚴陣以待。他提醒地壇醫(yī)院要做好準備:“只要一有非典疫情,在啟動三級預(yù)警后,就要立即啟用地壇醫(yī)院,接到命令后,24小時內(nèi)人員就要全部到位,設(shè)備到位,具備接收患者的條件?!?/p>
“當某一不明病因的流行病侵襲人類時,人們對它的反應(yīng)顯示了人類對未知事物的恐
懼”(The terror of the unknown is seldom better displayed than by the response of an epidemic,particularly when the epidemic strikes without apparent cause)[1]。1977 年愛德華?凱斯曾用這句話來描述當時公眾對新出現(xiàn)的軍團病的恐慌心理,現(xiàn)在我們同樣面臨著一場不明病原體的新型非典型肺炎—嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS),這句話似乎同樣適用于對當前人們心理的描述。不可否認,一部分公眾對這場新的流行疾病存在恐慌心理,這種恐慌部分原因是出于對新疾病的不完全了解,對于這種疾病的病原體、傳播方式、致病機理、發(fā)病經(jīng)過、診斷治療預(yù)防等仍然缺乏進一步的認識。不過,幸運的是人類采取了積極的應(yīng)對措施,WHO組織國際實驗室網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合展開對SARS 的研究,相關(guān)研究機構(gòu)在不到兩個月時間內(nèi)即找到了病原體并破譯了其基因組序列,初步揭開了SARS 的神秘面紗。目前,專家們已經(jīng)取得了一定的進展,研究發(fā)現(xiàn)SARS 疾病同一種新型冠狀病毒有關(guān),而這種新病毒以前沒有在人體或動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過,這一發(fā)現(xiàn)為下一步的工作奠定了堅實基礎(chǔ),專家將繼續(xù)揭開這種疾病的更多的未知之處。研究人員通過全球性的協(xié)作,借助于互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和多種研究手段,在短短兩個月時間內(nèi)就鑒定出病原體。而在20 多年前,研究人員尋找HIV 病毒時用了兩年多時間,隨后又花費幾年時間才獲得其核苷酸序列。與之相比,對尋找SARS 病原體的快速反應(yīng)令人印象深刻。如果我們大致回顧發(fā)現(xiàn)病原體的過程,或許可以得到新的經(jīng)驗,為進一步的研究提供基礎(chǔ),為未來可能爆發(fā)的另一場流行病提供經(jīng)驗。
研究進展
1.1 SARS 病原體的確認
2003 年3 月15 日,WHO 組織國際研究網(wǎng)絡(luò),相繼有11 個國家的實驗室參加,我國于
4 月初加入。研究網(wǎng)絡(luò)的進展過程大致如下。
3 月18 日,德國通過電鏡從咽拭子標本中觀察到副粘病毒,同時香港中文大學(xué)獲得副粘病毒的基因擴增產(chǎn)物,并在網(wǎng)絡(luò)上公布電鏡圖片和基因序列。
3 月19 日,新加坡從病人呼吸道標本中發(fā)現(xiàn)副粘病毒顆粒并獲得較微弱的病毒基因擴增產(chǎn)物(根據(jù)香港中文大學(xué)提供的引物)。國際上首先發(fā)現(xiàn)副粘病毒的荷蘭鹿特丹實驗室獲得有關(guān)病人的標本。
3 月20 日,國際上有4 個實驗室開始進行副粘病毒檢測。荷蘭鹿特丹實驗室檢測到副粘病毒,但是副粘病毒基因擴增為陰性,該實驗室將檢測試劑送到新加坡和香港,加拿大實驗室將雙份血清送到鹿特丹。
3 月21 日,香港中文大學(xué)科學(xué)家用猴腎細胞培養(yǎng)方法獲得病毒分離物,隨即研制了相應(yīng)血清學(xué)診斷試劑。許多家實驗室的研究結(jié)果顯示此次病原體與下列病原體無關(guān):甲、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,副流感病毒1、2、3 型,腺病毒,鼻病毒,腸道病毒,人間質(zhì)肺炎病毒,肺炎支原體,肺炎衣原體;同時電鏡觀察到病毒顆粒為50-60nm,血清實驗證明加入病人血清可以抑制細胞病變而對照血清無效。
3 月21 日,鹿特丹實驗室發(fā)現(xiàn)在德國的3 個新加坡病人呼吸道標本的HMPV 病毒PCR
檢測為陰性。并且,兩個可疑病例的呼吸道標本接種Vero 細胞和猴腎細胞均發(fā)現(xiàn)病變。也是在這一天,英國科學(xué)家檢測該兩病人標本中的H3N2 流感病毒;中國病毒專家洪濤宣布衣原體是引起SARS 的主要病原體,但不排除衣原體和冠狀病毒同時作用。
3 月21 日,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所祝慶余、秦鄂德研究員等通過多方面的研究,成功從SARS 患者尸解標本中分離出冠狀病毒樣病毒,推斷可能是SARS 的病原體,并將這一重要結(jié)果向解放軍總后勤部衛(wèi)生部和國家衛(wèi)生部進行了書面匯報。
3 月22 日,香港病毒實驗室電鏡發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒(70nm),美國從泰國病人標本得到的細胞病變產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒(70-100nm),但同一份標本獲得HMPV 病毒PCR陽性結(jié)果。與此同時,加拿大、法國、新加坡等地開始使用PCR 和電鏡方法檢測副粘病毒和HMPV 病毒。加拿大發(fā)現(xiàn)20nm 的病毒顆粒并且發(fā)布HMPV 病毒的基因進化樹。
3 月23 日,香港病毒實驗室在8 份標本中發(fā)現(xiàn)2 份冠狀病毒RNA 陽性。美國報道在香
港標本中發(fā)現(xiàn)冠狀病毒,同時建立免疫熒光檢測病人血清的方法,并將冠狀病毒的基因擴增引物在網(wǎng)絡(luò)上公布。在新加坡和香港開始用鼻咽拭子樣本感染支氣管的方式進行靈長類動物實驗。加拿大和法國分別以電鏡觀察和PCR 技術(shù)檢測到冠狀病毒。德國、日本、新加坡從Vero 細胞中分離到病毒。英國實驗室在可疑病例呼吸道和尿標本中檢測到雞肺炎病毒序列。
3 月24-26 日,德國、香港的實驗室分別以電鏡觀察和PCR 技術(shù)檢測到冠狀病毒,德國
實驗室獲得病毒序列,證實新病毒的氨基酸序列與已知冠狀病毒的多聚酶氨基酸序列相符,德國、荷蘭、香港等地實驗室獲得更多的基因擴增序列,并在網(wǎng)絡(luò)上公布新病毒的基因進化樹。
3 月27-31 日,繼續(xù)進行以猴子為實驗對象的動物實驗。香港和美國實驗室分別證實正
常人血清與新分離病毒為陰性反應(yīng)。與此同時,有更多的實驗室檢測到冠狀病毒:日本從新加坡標本中獲得陽性結(jié)果;香港檢測了50 份病人血清,其中27 份冠狀病毒抗體升高,同時人們還從10 份病人糞便樣本中發(fā)現(xiàn)5 份為病毒檢測陽性,并且發(fā)現(xiàn)發(fā)病后6-16 天病人糞便中可以檢測到病毒基因;加拿大在病人標本中發(fā)現(xiàn)人類副粘病毒。
4 月1-8 日,在動物實驗中用副粘病毒和間質(zhì)肺炎病毒共同感染的猴子出現(xiàn)臨床癥狀。
美國研究人員用ELISA 方法從發(fā)病20 天的病人血中檢測到抗體。香港研究人員用免疫熒光方法從發(fā)病10 天的病人血清中檢測到IgM 抗體。小白鼠實驗開始啟動。更多實驗室在Vero培養(yǎng)細胞中分離到冠狀病毒,又有一些血清學(xué)實驗證實,SARS 疾病為副粘病毒和冠狀病毒復(fù)合感染。荷蘭、德國、香港和美國相繼發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的新序列,德國科學(xué)家在標本中發(fā)現(xiàn)衣原體。
4 月9 日,中國疾病預(yù)防控制中心和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所在軍事醫(yī)學(xué)科
學(xué)院舉行了有關(guān)SARS 病原體研究座談會,雙方有關(guān)專家分別介紹了衣原體和冠狀病毒方面的研究進展。
4 月10 日下午,著名病毒學(xué)專家、中國工程院院士洪濤在舉行的“非典型肺炎防治知識介紹會”上向中外數(shù)十家媒體宣布:“對非典型肺炎病原體的研究目前初見成效,已找到兩種主要病原體--衣原體和冠狀病毒樣病毒”。
4 月10 日,據(jù)新華社報道,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所李德新教授、畢勝利教授、段淑敏主任和許文波教授等科技人員,在非典型肺炎的病原學(xué)研究上取得重大突破,成功分離到數(shù)株冠狀病毒,克隆了所分離到的冠狀病毒部分基因。他們在三例死于非典型肺炎病人的肺標本和其中一例的脾標本進行了冠狀病毒檢測,并從這些標本中提純并擴增出冠狀病毒基因,經(jīng)過核苷酸序列測定證實所擴增基因為冠狀病毒的RNA 聚合酶基因,從而在世界上首次用分子生物學(xué)手段證實了病人器官內(nèi)存在冠狀病毒。他們把新病毒和其他冠狀病毒的基因序列進行比較,發(fā)現(xiàn)存在于非典型肺炎病人體內(nèi)的冠狀病毒為一種變異冠狀病毒。用這些標本進行多種細胞培養(yǎng),成功分離到新冠狀病毒,病毒在培養(yǎng)細胞中數(shù)次傳代,均穩(wěn)定出現(xiàn)細胞病變,對該病毒的基因檢測持續(xù)陽性。從國內(nèi)非典型肺炎病人咽拭子中分離到三株冠狀病毒,這些病毒的核苷酸序列和從病人臟器中分離到的冠狀病毒核苷酸序列相同。目前獲得的研究結(jié)果,在很大程度上表明冠狀病毒可能是引起非典型肺炎的病原體。
4 月11 日,新華社公布了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所祝慶余、秦鄂德兩位研究員的發(fā)現(xiàn)。2 月底,該研究所從一例SARS 患者尸解標本中分離并辨認出冠狀病毒。截止到3 月21 日,通過血清學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究,獲得了關(guān)于冠狀病毒的進一步證明。4 月9 日,對分離出的4 株冠狀病毒進行了序列測定。4 月16 日公布了這些結(jié)果。
4 月12 日,加拿大溫哥華不列顛哥倫比亞癌癥研究所Holt 博士及其研究組公布了SARS
嫌疑病原體的基因組序列。
4 月14 日,美國亞特蘭大CDC 的Anderson 博士研究小組也完成了基因組測序并在網(wǎng)上
公布,兩個研究小組的測序結(jié)果基本一致。
4 月16 日,WHO 負責傳染病的執(zhí)行干事戴維?海曼宣布,經(jīng)過全球科研人員通力合作,正式確認一種變異冠狀病毒引起SARS。
4 月17 日,WHO 在日內(nèi)瓦召開的新聞發(fā)布會宣布:完成病原體確定的最后一步工作,
即“科赫推定”中的第四步。由荷蘭Erasmus 大學(xué)Albert Osterhaus 博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組成功地用新冠狀病毒使實驗用猴子染病,進而該研究小組從被感染猴子體內(nèi)分離出該病毒并進行了實驗室培養(yǎng)。表明全球科學(xué)家在一個月的通力合作后,初步確定了SARS 的病原體[2-9]。
4 月22 日,中國公布“非典”元兇冠狀病毒圖[3][7][10] 。
1.2 SARS 病毒基因組解碼進展
1.2.1 加拿大史密斯基因科學(xué)中心
4 月12 日,加拿大科學(xué)家破解SARS 疑似病原體的基因,朝開發(fā)SARS 診斷方法以及研
發(fā)SARS 疫苗、藥物邁出第一步。
位于溫哥華的史密斯基因科學(xué)中心投入全球?qū)筍ARS 的行列。中心主任馬拉說,基因
編碼是科學(xué)家研發(fā)診斷檢驗方法所需的基本資料。史密斯基因科學(xué)中心破解此基因編碼之后,立即在國際網(wǎng)絡(luò)上公布(http://www.bcgsc.bc.ca)以提供給世界各地其它科學(xué)家使用。
1.2.2 香港大學(xué)
港大微生物學(xué)系主任袁國勇表示,港大醫(yī)學(xué)院完成引發(fā)SARS的冠狀病毒基因序列測定,確定是一種全新病毒,懷疑是由動物傳播到人,至于是什么動物,則有待研究。袁國勇認為,這項發(fā)現(xiàn)有助于改善目前的快速測試方法。此前,香港中文大學(xué)的研究人員已于13 日晚將他們破解的新型冠狀病毒部分基因序列交給世界衛(wèi)生組織的“SARS”工作小組。
1.2.3 美國疾病預(yù)防控制中心
美國疾病預(yù)防控制中心4 月14 日宣稱,已經(jīng)完成了對被認為是引起SARS 全球流行的
新冠狀病毒基因組的測序。其基因測序結(jié)果與加拿大一個實驗室的測序結(jié)果基本一樣。對兩家機構(gòu)的測序結(jié)果比較后,發(fā)現(xiàn)其中的區(qū)別在于他們的測序結(jié)果有15 個額外的核苷酸,而這將是繼續(xù)開展測序工作的重大開端。測序結(jié)果是在10 名科學(xué)家及許多技術(shù)人員的共同努力下,工作了12 天后得出的。研究人員將其中一例SARS 患者的咽喉分泌物,在非洲綠猴腎細胞中進行傳代細胞培養(yǎng),對引起該疾病的冠狀病毒的核酸序列提純后擴增測序。新的基因序列共有29,727 個核苷,在典型的冠狀病毒家族核糖核酸界值之內(nèi),冠狀病毒家族成員一般有29,000 至31,000 個核苷。美國疾病預(yù)防控制中心主任Julie Gerberding 博士談到,確定一種新型病毒的基因序列對于疾病的治療和預(yù)防都是十分重要的。利用有關(guān)基因序列的信息,可以開始進行有關(guān)抗病毒藥物的實驗室研究工作,可以作為研制疫苗的基礎(chǔ),也可以發(fā)展診斷性測試以便早期發(fā)現(xiàn)病例。美國和加拿大的研究結(jié)果幾乎相同,這一點十分重要,表明病毒可能有共同的來源,因為這些樣品是從在不同國家受到感染的不同的個體中采集的。但美國疾病預(yù)防控制中心的官員強調(diào),對于病毒的分析工作還遠遠沒有完成,冠狀病毒能夠
快速變異,研究人員需要將由細胞培養(yǎng)分離到的病毒與從SARS 患者的患病組織中所獲得的病毒加以比較,所開展的基因測序工作將會加快比較工作的進行。
1.2.4 中國科學(xué)院北京基因組研究所與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
中國科學(xué)院北京基因組研究所與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所通力合作,于2003年4 月16 日完成了對分離自不同SARS 病例的四株冠狀病毒的基因組解碼工作。結(jié)果顯示,這一病毒的長度約為3 萬個堿基對,與加拿大、美國報告的序列基本一致,屬于一種新型冠狀病毒,這一成果僅比加拿大科學(xué)家宣布破譯冠狀病毒基因的時間晚兩天。冠狀病毒全基因組序列的成功測定,為追蹤冠狀病毒的來源,研制非典型性肺炎的診斷制劑、疫苗和治療藥物奠定了堅實的基礎(chǔ),使我國的非典型肺炎防治工作向前邁出重要一步[2][3][4][5][8][10]。
2 研究人員分離并鑒定病原體
在這場全球相關(guān)實驗室聯(lián)合尋找病原體的行動中,香港研究人員率先取得了突破,他們以傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)、血清學(xué)檢測技術(shù)以及現(xiàn)代分子遺傳學(xué)方法,鑒定了50 例SARS 患者體內(nèi)的病原體—一種新冠狀病毒。另外,對對照組樣本的分析進一步支持了他們關(guān)于病原體的論點:在40 例來自患有其它呼吸疾病患者的呼吸道樣本中,沒有檢測到一份樣本含有新冠狀病毒的RNA;對來自血液捐獻者的200 份血清樣本中,沒有一份含有這種病毒的抗體。
這些發(fā)現(xiàn)同時支持了另兩家研究機構(gòu)所提出的觀點,美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)和加拿大多倫多的相關(guān)研究機構(gòu)同樣在SARS 患者體內(nèi)分離到了這種新型冠狀病毒,并認為該病毒與SARS 爆發(fā)有聯(lián)系。德國研究人員在最初的三例患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒,并且進一步收集了來自越南河內(nèi)的患者樣本進行檢驗分析,結(jié)果也支持該結(jié)論。
2.1 國際實驗室網(wǎng)絡(luò)的研究結(jié)果
2.1.1 中國香港
香港大學(xué)微生物學(xué)系教授Peiris 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組對香港的患者進行了研究以尋找病原
體。
該小組選擇了香港三家急救醫(yī)院收治的50 例符合WHO 修改定義的SARS 患者,收集
了所有患者的咽拭樣本和血清樣本,選擇了部分患者分別收集嚴重期和康復(fù)期的血清和排泄
物樣本。另外,他們?nèi)〉靡焕颊叻谓M織樣本,進行了病毒培養(yǎng)分離、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
、常規(guī)的組織放射自顯影和電鏡觀察。用其他病人的咽拭樣本、排泄物和血清樣本的微生物
檢測結(jié)果作為對照。
研究人員最初進行了常規(guī)的血液檢查、生化檢查以及微生物檢查,對血液樣本、咽拭樣
本分別進行了細菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測,對咽拭樣本進行快速熒光抗原檢測,以確定病原體是
否為常見呼吸道感染病毒,并且用多種細胞進行培養(yǎng)以分離病原體;用臨床樣本直接進行
RT-PCR,以檢測是否為A 型流感病毒和人副粘病毒感染。另外,對培養(yǎng)細胞采用了ELISA
方法以檢測是否存在衣原體。
研究的突破在于從兩名患者的樣本中分別觀察到了冠狀病毒樣顆粒。樣本之一來源于一
名53 歲男性患者,在他的咽拭樣本、肺活組織切片等樣本中檢測到冠狀病毒RNA,患者本
身冠狀病毒抗體滴度顯著升高(1/200~1/1600)。另一樣本取自一名42 歲女性患者,PCR 檢
測對冠狀病毒呈陽性,她本身的血清抗體有變化(1/150~1/1600)。
研究人員分別對兩個樣本進行培養(yǎng)細胞接種,2-4 天后出現(xiàn)圓形折光的病變細胞,表明
有病原體分離,分離到的病原體不和識別常見病毒的試劑板反應(yīng)。對細胞培養(yǎng)的提出物進行
42
高速離心,隨即進行了電鏡負染色觀察,發(fā)現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則的包膜病毒,直徑約80-90nm,表
面特征與冠狀病毒相似。對被感染細胞超薄切片進行電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)和細胞膜表面均
存在類似病毒顆粒,并且從兩名患者體內(nèi)分離出的病毒大小和形態(tài)特征很相似。
為獲得新分離病毒的基因序列信息,研究人員進行了隨機RT-PCR,克隆測序了病毒感
染細胞的特征染色體帶,在GenBank 中進行了同源序列比較,在被檢測的30 個克隆中發(fā)現(xiàn)
了一個未知序列。對這段DNA 序列進行分析,發(fā)現(xiàn)與冠狀病毒存在低同源性,但由其推出
的氨基酸序列與冠狀病毒科的牛冠狀病毒和鼠肺炎病毒RNA 聚合酶存在高同源性(57%),
蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究顯示新病毒與冠狀病毒Group2 高度相關(guān)。對病毒血清學(xué)反應(yīng)采
用了間接免疫熒光檢測,結(jié)果顯示在32 例患者嚴重期和康復(fù)期的血清對比中,均出現(xiàn)血清
轉(zhuǎn)化,存在冠狀病毒的抗體滴度增長的現(xiàn)象。
研究小組還對人副粘病毒進行了RT-PCR 和血清抗體滴度檢測,結(jié)果顯示陰性,也未
檢測到其它病原體。因此,研究小組認為分離到的冠狀病毒就是SARS 的病原體或一個必需
的因子,不過,是否有其它的微生物或非微生物輔助因子起作用,則有待觀察[11][12]。
2.1.2 德國
最初SARS 爆發(fā)于亞洲,由于洲際旅行該疾病從亞洲傳播到其它大洲。鑒于SARS 疾病
是一種新出現(xiàn)的病癥,人類對其病原體一無所知,最初的研究工作集中于對病原體的鑒定。
WHO 組織了國際實驗室網(wǎng)絡(luò),集中各有關(guān)國家的研究力量以找出SARS 的病原體。德國研
究機構(gòu)作為該網(wǎng)絡(luò)的一份子,也對病原體的鑒定展開了研究。
該研究小組最初選擇的樣本來自于同一家庭中的三個人:一名32 歲的男性患者、他的
妻子以及他的岳母。該男性為新加坡一名內(nèi)科醫(yī)生,曾治療過一名SARS 患者而被感染,繼
而他感染了他的妻子和岳母。三人因故由新加坡到美國,該醫(yī)生在美國期間出現(xiàn)癥狀,他告
知了他的新加坡同事,該同事向WHO 作了匯報,WHO 在三人返回新加坡的航班中轉(zhuǎn)站—
法蘭克福對他們進行隔離。德國相關(guān)研究人員取得了他們的呼吸道樣本和血液樣本,隨后該
小組還獲得了來自亞洲的其他18 名可疑或可能SARS 病例的樣本,以及21 名接觸過SARS
患者但未被感染人員的樣本。
研究人員首先對上述3 例患者的樣本進行了PCR 檢測,以鑒定是否存在肺炎雙球菌、
肺炎衣原體、人巨細胞病毒、副流感病毒、流感病毒、人副粘病毒、鼻病毒及人冠狀病毒
OC43 和229E 型等已知呼吸道病原體;對呼吸道樣本進行抗原ELISA,以檢測是否存在肺
炎球菌、流感病毒及呼吸道合胞病毒,同時對血液樣本進行了血清學(xué)檢測;另外,研究人員
對呼吸道樣本和血液樣本負染以進行電鏡觀察,并將樣本進行培養(yǎng)細胞接種。
研究人員用痰液樣本進行了RNA 抽提,以隨機RT-PCR 技術(shù)分析,所設(shè)計的一些PCR
引物含有簡并性位點,并且多數(shù)引物3’端為T 堿基,以便DNA 多聚酶在引物末端堿基不
完全匹配的情況下能夠生效。使用了BLAST 工具對克隆擴增的產(chǎn)物進行了同源性比較。
研究小組通過對三例患者的樣本進行的多次檢測,針對已知呼吸道病原體的檢測結(jié)果
多為陰性,電鏡觀察呼吸道樣本時發(fā)現(xiàn)了稀少的副粘病毒樣顆粒,但隨后的數(shù)次針對副粘病
毒家族的PCR 檢測均顯示陰性。痰液樣本接種培養(yǎng)細胞6 天后,研究人員發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中存
在病變細胞,隨即進行了RNA 抽提,對提取的RNA 進行RT-PCR,擴增克隆出約20 個不
同的DNA 片段,對這些片段測序后以BLAST 進行檢索,發(fā)現(xiàn)三個新的片段,新片段不與
數(shù)據(jù)庫中的序列匹配,但由新片段推出的氨基酸序列顯示了與冠狀病毒家族的同源性,表明
分離了一種新冠狀病毒。研究人員將新片段與美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)所測得的新
病毒核酸序列進行了對比,發(fā)現(xiàn)存在同源性。在對這三例患者的血清樣本以及被感染的培養(yǎng)
細胞進行了免疫熒光檢測,以確定是否存在抗體。在兩名患者的血清中檢測到IgG 抗體升高,
表明存在新冠狀病毒的血清反應(yīng)。
43
為檢驗新病毒是否同SARS 相聯(lián)系,研究人員進一步收集了來自可能或可疑SARS 患者
及同SARS 患者有過接觸但未被感染人員的樣本(進一步收集的樣本均來自越南河內(nèi)),對
這一批樣本進行了巢式PCR 分析,結(jié)果在可能SARS 病例中發(fā)現(xiàn)病毒的比例是100%,在可
疑病例中是23%,但在健康接觸者中未發(fā)現(xiàn)病毒,這些數(shù)據(jù)或許可進一步證明新冠狀病毒和
SARS 的聯(lián)系。
該研究小組還曾檢測到副粘病毒及肺炎球菌,但隨后的針對性PCR 實驗結(jié)果為陰性。在
幾例患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了衣原體感染,但并沒有在其他SARS 患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。因此研究人員還不
清楚這些病原體在SARS 疾病中是作為致病因子還是聯(lián)合致病因子[13]。
2.1.3 美國
美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)是WHO 所組織的國際實驗室網(wǎng)絡(luò)的研究機構(gòu)之一,他
們也展開了對SARS 病原體的鑒定工作。CDC 的樣本來自于越南、新加坡、泰國、加拿大
、中國香港、臺灣和美國等的SARS 患者,試圖從一系列已知的病原體中鑒定出引起此次
SARS 爆發(fā)的病源。
由于SARS 患者的臨床癥狀沒有特異性,最初的研究側(cè)重于對已知的呼吸道病原體的排
查,綜合使用了多種檢測方法。研究人員收集了包括血液、血清、鼻咽拭子、含嗽液和器官
組織在內(nèi)的多種樣本,在多種細胞中進行了培養(yǎng),并對乳鼠進行了注射接種,以分離病原體;
觀察培養(yǎng)細胞和乳鼠,對出現(xiàn)病變的細胞或個體制備切片以進行電鏡觀察;對血清樣本進行
了血清學(xué)實驗以檢測抗體;進行了一般的和特殊的細菌培養(yǎng),還利用了分子生物技術(shù)如PCR
、RT-PCR;對多種呼吸道病原體進行了篩選,如耶爾森氏菌、支原體、衣原體、立克次體
、軍團桿菌、流感病毒A、B 型,副流感病毒家族等。
研究的突破在于通過電鏡觀察到了冠狀病毒樣顆粒。以患者呼吸道樣本接種的培養(yǎng)細
胞出現(xiàn)了細胞病變,對出現(xiàn)病變的細胞制作超薄切片,進行電鏡觀察,在病變細胞內(nèi)及細胞
膜發(fā)現(xiàn)了冠狀病毒樣顆粒:直徑約80-140nm,病毒表面有20-40nm 結(jié)構(gòu)復(fù)雜的突出物。利
用電鏡觀察患者支氣管沖洗液樣本,同樣發(fā)現(xiàn)了許多被感染細胞均存在冠狀病毒。
研究人員對病變細胞進行了RNA抽提和RT-PCR 以擴增新病毒序列,引物根據(jù)GenBank
中的已知冠狀病毒的序列信息而設(shè)計。對擴增后的純化產(chǎn)物進行了測序分析,與已公布的冠
狀病毒序列進行了比對,并利用生物信息學(xué)技術(shù)分析,得出該病毒的進化樹。新病毒與其他
冠狀病毒的序列以及由序列推出的氨基酸序列進行比較,發(fā)現(xiàn)新病毒與冠狀病毒家族group2
有較高的同源性。但分析進化樹顯示,這種病毒在遺傳學(xué)上與其它冠狀病毒均有不同,表明
分離的是一種新型冠狀病毒。對樣本進行的血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),以感染細胞切片與處于恢復(fù)期
的SARS 疑似患者血清進行反應(yīng),來自香港、曼谷和美國的SARS 疑似患者血清呈特異性反
應(yīng),呈現(xiàn)從陰性到陽性轉(zhuǎn)變或在間接熒光抗體實驗中反應(yīng)性增高;對同一批血清樣本進行
ELISA 抗原檢驗,恢復(fù)期樣本的的反應(yīng)呈高特異性,抗體滴度也逐漸升高。
經(jīng)過樣本接種培養(yǎng)細胞擴增病原體,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病原體為冠狀病毒屬,分子生物學(xué)研
究進一步確定新病毒的本質(zhì)特征,血清學(xué)實驗確定了與疾病的聯(lián)系,因此研究人員認為分離
到的新型冠狀病毒有可能是SARS 的病原體。不過該研究小組同時指出:患者病灶組織細胞
中新冠狀病毒抗原或病毒RNA 還未在病理過程中被直接檢測到。同時,還不能證實新病毒
存在于所有SARS 患者體內(nèi),一些SARS 患者未檢出冠狀病毒,需要進一步的相關(guān)研究[14][15]。
2.1.4 加拿大
加拿大國家微生物實驗室以及相關(guān)研究機構(gòu)組織了SARS 研究小組,展開了對SARS
疾病的研究。
研究人員經(jīng)過追蹤調(diào)查,證實該國最初的SARS 患者曾經(jīng)去過香港并在那里被感染,
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該患者返回加拿大并且將SARS 疾病傳播到該國。研究人員所取得的樣本即來自該患者(已
死亡)直接或間接傳染的9 名患者。研究人員對1 例尸檢組織樣本進行了組織病理學(xué)檢查,
對全部9 例患者的樣本進行了微生物學(xué)檢測。對尸檢組織樣本進行了免疫組織化學(xué)檢驗,以
檢測是否存在流感病毒A、B,呼吸道合胞病毒、腺病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、腸病毒、
黃病毒等已知常見病毒,以及立克次體、肺炎支原體、肺炎衣原體、耶爾森氏菌等,所有檢
測結(jié)果均為陰性。對9 例患者的血液樣本、呼吸道樣本以及尿液樣本進行了常規(guī)的細菌和真
菌檢測,并對這些樣本進行了培養(yǎng),結(jié)果顯示陰性,另外針對軍團菌的專門檢測亦顯示陰性。
研究人員對呼吸道樣本進行了常見細菌的分子生物學(xué)檢測,抽提了DNA,進行了針對常見
肺炎菌,耶爾森氏菌及衣原體等微生物的RT-PCR,結(jié)果同樣顯示陰性。
研究人員還進行了常見病毒的檢測,對9 例患者的所有呼吸道樣本和糞便樣本進行了常
規(guī)的直接病毒檢測,包括電鏡觀察和直接熒光抗體檢測,沒有在樣本中發(fā)現(xiàn)流感病毒A、B,
副流感病毒1、2、3,腺病毒、呼吸道合胞病毒等。同樣,針對常見呼吸道病毒,研究人員
也進行了病毒的分子生物學(xué)檢測,大多數(shù)的檢測結(jié)果顯示陰性,但對支氣管沖洗液樣本以及
咽拭樣本進行的巢式RT-PCR 發(fā)現(xiàn)了人副粘液病毒,并且排除了實驗室交叉感染的可能性。
另外,從以呼吸道樣本接種的培養(yǎng)細胞中分離了一種新型冠狀病毒,在9 例SARS 患者中5
例患者的樣本分離出了這種病毒,在4 例患者的樣本中分離到了副粘液病毒。至此,該研究
機構(gòu)、香港研究小組和美國CDC 研究人員均報道了在SARS 患者體內(nèi)分離到了新型冠狀病
毒。研究人員隨后對新病毒進行RT-PCR,擴增克隆了病毒的核苷酸序列,并對其進行了測
序,以生物信息學(xué)技術(shù)對測序結(jié)果進行了分析:新病毒的序列和已知冠狀病毒的序列均不同,
但是由該序列推出的氨基酸序列與已知幾種冠狀病毒的氨基酸序列有較高同源性(78%),
新病毒的生物進化樹分析顯示新病毒同已知的冠狀病毒家族(group1、group2 和group3)均
不十分接近。
基于已有的發(fā)現(xiàn),研究人員得出結(jié)論,認為所分離的人副粘病毒和新冠狀病毒可能都與
SARS 疾病相聯(lián)系,但還不清楚是兩者聯(lián)合作用,還是兩病毒分別單獨作用,甚或還有其它
未被檢測出的病毒在起作用,需要進一步研究以證實[16]。
2.2 中國
中國疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制所洪濤院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組就SARS 的病原體展
開了研究,經(jīng)電鏡觀察到SARS 患者尸檢標本中發(fā)現(xiàn)了衣原體和冠狀病毒顆粒,并在《中華
醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表了他們的研究文獻。
該研究小組選擇的樣本來自7 例因患SARS 死亡的患者,研究人員采集了死者的臟器
組織標本,制作了電鏡標本和病理標本。7 名死者中4 例來自廣東,1 例來自山西,1 例來
自北京,1 例為死于成都的香港患者,具有一定代表性。為分離病原,將病人肺組織提取物
接種于293 細胞(人胚腎轉(zhuǎn)化細胞系),并且對病人組織及其分離的病原進行免疫學(xué)鑒定,采
取了間接免疫熒光和免疫組織化學(xué)
截至2003年7月11日患病人數(shù)為8069人。
張文康當時在記者發(fā)布會的原話是“中國大陸自2003年初發(fā)現(xiàn)非典型肺炎以來,截至3月31日,共報告非典型肺炎1190例,其中廣東省1153例、北京市12例、山西省4例,另外經(jīng)回顧性調(diào)查,廣西壯族自治區(qū)11例、湖南省7例、四川省3例。
已經(jīng)治愈出院的共934人,占總病例數(shù)的78.5%。其中廣東911例、北京1例、廣西8例,湖南、山西、四川的所有病例全部治愈出院,并且未發(fā)生新的病例。在這次疫情中,共死亡46例,其中廣東40例、北京3例、廣西3例,山西、湖南、四川沒有死亡病例?!?/p>
事后衛(wèi)生部常務(wù)副部長高強接受記者采訪時說不認同張文康因隱瞞疫情被免職,也不認同中國政府隱瞞疫情,聲稱中國官方第一次公布SARS疫情是2月11日,2月12日的人民日報新華社已經(jīng)明確提出來,在廣東地區(qū)出現(xiàn)一種叫非典型肺炎的疾病。在中國廣東政府第一次發(fā)布疫情的時候,世界上任何其他地方還沒有發(fā)生SARS,這個發(fā)布本身就是對世界的警告。
擴展資料:
非典潛伏期1~16天,常見為3~5天。起病急,傳染性強,以發(fā)熱為首發(fā)癥狀,可有畏寒,體溫常超過38℃,呈不規(guī)則熱或弛張熱,稽留熱等,熱程多為1~2周;伴有頭痛、肌肉酸痛、全身乏力和腹瀉。起病3~7天后出現(xiàn)干咳、少痰,偶有血絲痰,肺部體征不明顯。病情于10~14天達到高峰,發(fā)熱、乏力等感染中毒癥狀加重,并出現(xiàn)頻繁咳嗽,氣促和呼吸困難,略有活動則氣喘、心悸,被迫臥床休息。這個時期易發(fā)生呼吸道的繼發(fā)感染。
病程進入2~3周后,發(fā)熱漸退,其他癥狀與體征減輕乃至消失。肺部炎癥改變的吸收和恢復(fù)則較為緩慢,體溫正常后仍需2周左右才能完全吸收恢復(fù)正常。輕型患者臨床癥狀輕。重癥患者病情重,易出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征。兒童患者的病情似較成人輕。有少數(shù)患者不以發(fā)熱為首發(fā)癥狀,尤其是有近期手術(shù)史或有基礎(chǔ)疾病的患者。
-SARS事件
-非典
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