胃癌與免疫-淋巴細(xì)胞過繼免疫

當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞有殺傷腫瘤細(xì)胞之后，曾致力于被動輸入淋巴細(xì)胞，但是輸入一般胸腺細(xì)胞，效果不甚明確，自1976年以來，開始用淋巴因子，特別是用白介素刺激淋巴細(xì)胞增生以來，有很大發(fā)展。

LAK細(xì)胞

LAK細(xì)胞是淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（lymphokine acitvated killer）的簡稱，1976年，morgan發(fā)現(xiàn)絲裂原刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中存在一種因子，它能夠選擇性地維持T淋巴細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)，人們將它稱為T細(xì)胞生長因子，1979年統(tǒng)一將白細(xì)胞之間相互作用的因子統(tǒng)稱為白細(xì)胞介素（Interleukin,IL），對T淋巴細(xì)胞生長因子稱為白細(xì)胞介素-2，繼而有人（Yrom 及Rosenberg,1980）證明人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)IL-2培養(yǎng)后，誘導(dǎo)出一種具有抗腫瘤高活性的殺傷細(xì)胞，后來稱為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞，即LAK細(xì)胞。

LAK細(xì)胞的特點：LAK細(xì)胞不需抗原刺激，就能殺傷NK細(xì)胞所不能殺傷的腫瘤細(xì)胞，殺傷作用不受MHC限制，它可殺傷同基因型，同種異體，甚至異種異體瘤細(xì)胞，LAK細(xì)胞的類型不一，人外周血淋巴細(xì)胞中的LAK細(xì)胞的前體細(xì)胞表達(dá)有NK細(xì)胞的標(biāo)志，有Leu19及Leu11（CD16）的標(biāo)志，但是沒有T細(xì)胞的標(biāo)志，它和NK細(xì)胞相似，又不同于NK細(xì)胞，可能來源于另一細(xì)胞郡。

LAK細(xì)胞的抗癌效果：IL-2及淋巴細(xì)胞單獨時殺傷瘤細(xì)胞，治療腫瘤的效果很差。

IL-2/LAK細(xì)胞療法存在 的問題，①副作用明顯，常見的復(fù)作用是毛細(xì)血管滲漏綜合征（Gapillary leak syndrome），主要表現(xiàn)為全身性水腫及多臟器功能失調(diào)，嚴(yán)重者可致胸，腹腔積液，肺間質(zhì)水腫，呼吸緊迫綜合征及充血性心力衰竭，發(fā)熱是病人常見的現(xiàn)象，②是來源困難，LAK細(xì)胞需要量大，最好在109以上，因此用外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)達(dá)到這種數(shù)量有一定困難，此外，IL-2需要量也大。

其它LAK細(xì)胞：除IL-2產(chǎn)生LAK細(xì)胞外，另有許多產(chǎn)生LAK細(xì)胞的方法，現(xiàn)介紹主要的兩種。

CD3/LAK細(xì)胞，T細(xì)胞表面有CD3分子，與T細(xì)胞受體組成CD3-T細(xì)胞受體復(fù)合物，因此CD3的單克隆抗體對T細(xì)胞有強(qiáng)絲裂原作用，單獨使用CD3抗體，對淋巴細(xì)胞激活力量小，但用少量抗體 （腹水1份）與效應(yīng)細(xì)胞懸液（500份），外加微量IL-2（30單位/ml）進(jìn)行培養(yǎng)時，第二天淋巴細(xì)胞開始增殖，到第2～3周，可增殖到5×104倍以上，加CD3抗體培養(yǎng)的LAK細(xì)胞，大部分為T細(xì)胞，而且具有非MHC限制的細(xì)胞毒性，CD3/LAK細(xì)胞比單純IL-2/LAK細(xì)胞的細(xì)胞毒性高6～23倍。

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor,TNF），單獨使用不能誘導(dǎo)LAK細(xì)胞，但在IL-2以外加TNF，可增強(qiáng)LAK細(xì)胞的活性。

抗腫瘤單克隆抗體，與IL-2一起培養(yǎng)單個核細(xì)胞，也可增強(qiáng)LAK細(xì)胞殺傷該腫瘤細(xì)胞的活性。

抗胃LAK細(xì)胞的制備

單個核細(xì)胞的分離，取外周血，加肝素抗凝（50單位/ml血），加等量培養(yǎng)液1640混合后加在Fiooll分離液分層液面上離心20分鐘（2000轉(zhuǎn)/分），取中、上層交界處的白色云霧狀狹窄帶，即單個核細(xì)胞層，經(jīng)1640洗滌后制成細(xì)胞懸液。

用含10%小牛血清液及青霉素的培養(yǎng)液中加IL-2300單位/ml，制備IL-2/LAK細(xì)胞，加入1：500的CD3腹水及IL-230單位/ml，制備CD/LAK細(xì)胞。

LAK細(xì)胞的擴(kuò)增，至 第二周末IL-2/LAK細(xì)胞增長約20倍，CD3/LAK增長130倍。

抗胃癌LAK細(xì)胞的應(yīng)用效果

用IL-2/LAK細(xì)胞，以胃癌細(xì)胞系靶細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞毒試驗，以噻唑 蘭（MTT）為損傷 的批示劑可見它在適應(yīng)濃度時，對腫瘤細(xì)胞有40%的殺傷作用，而CD3/LAK可有60%的殺傷率，將胃癌細(xì)胞接種裸鼠皮下，第1周可長出瘤結(jié)節(jié)，用IL-2/LAK細(xì)胞及CD3/LAK細(xì)胞進(jìn)行治療，CK3/LAK細(xì)胞抑制腫瘤生長的效果，第6周才開始長出瘤結(jié)節(jié)（白云飛等，1992），臨床上使用LAK細(xì)胞對胃癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移有一定抑制作用（田志剛等，1987）。

TIL細(xì)胞

TIL細(xì)胞為腫瘤浸潤細(xì)胞（ Tumor infiltrating lymphayte,TIL）是繼LAK細(xì)胞之后，第二代抗腫瘤淋巴細(xì)胞。

TIL細(xì)胞的歷史：早在1922年就有人提出腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的概念，但在早期的研究著重從組織學(xué)看淋巴細(xì)胞浸潤的多少以及與癌的分型和預(yù)后的關(guān)系，繼而用機(jī)械的辦法進(jìn)行分離，1975年單克隆抗體技術(shù)問世以來，對淋巴細(xì)胞的亞型分析，使人們對這些細(xì)胞的亞型，如是B細(xì)胞還是T細(xì)胞，是T輔助細(xì)胞還是抑制細(xì)胞，有了進(jìn)一步的認(rèn)識，后來Rosenberg有膠原酶消化的方法替代機(jī)械分離，在IL-2的幫助下，TIL細(xì)胞對體外腫瘤細(xì)胞的殺傷，在體內(nèi)對有些腫瘤的治療都取得了肯定的效果，較LAK細(xì)胞的療效高出50～100倍。

TIL細(xì)胞的一般情況和療效：目前已建立了一套TIL細(xì)胞的 分離、提出和培養(yǎng)的方法，在體外實驗，動物實驗及病人體內(nèi)應(yīng)用，均取得了良好的效果，當(dāng)前已證明在黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、肉瘤和腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌等實體瘤中，TIL細(xì)胞可成千倍的擴(kuò)增，而且在動物實驗以及病人應(yīng)用時，都證明有一定效果，初步展示了TIL細(xì)胞的特殊抗癌活性。

胃癌TIL細(xì)胞的制備及應(yīng)用

①胃癌TIL細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：

取新鮮胃癌手術(shù)標(biāo)本，除去壞死組織，切碎，用Hank氏液洗去血液，再加入含0.1%的膠原酶、

0.002%DNA酶、0.01%透明質(zhì)酸酶及抗菌素的1640培養(yǎng)液，在室溫下攪拌過夜。,經(jīng)200目鋼網(wǎng)過濾,去除未消化的組織塊,再用Hank氏液或1640洗兩次，,制成2×106/ml左右的細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度密度離心潮(2000轉(zhuǎn)/分)20分鐘,吸取75%與100%分離液面之間的白色云霧層,富含TIL細(xì)胞,用Hank氏液洗滌,離心,末次離心后,用0.2%臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞,最后用24孔板培養(yǎng)。

培養(yǎng)時，培養(yǎng)液應(yīng)含10%人血清、青霉素、鏈霉素、兩性 兩性霉素，Hepes緩沖劑及L-谷氨酰胺，培養(yǎng)液中還需加1000單位/ml的IL-2，培養(yǎng)2～3周。

②TIL細(xì)胞體外及體內(nèi)殺傷瘤細(xì)胞的實驗：

以胃癌細(xì)胞系SGC-7901為靶細(xì)胞，經(jīng)過復(fù)蘇及培養(yǎng)后，將其 調(diào)成1×105/ml細(xì)胞數(shù),加入96孔板中,每孔100μl,再加入 不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞,與靶細(xì)胞構(gòu)成不同的比例,以MTT作為殺傷程度的指標(biāo),培養(yǎng)液中加過不同濃度的IL-2,在第14天,TIL細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷作用達(dá)到最高水平,而不加IL-2者,不出現(xiàn)殺傷,TIL細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷率一般為35%～50%。TIL細(xì)胞的優(yōu)點和存在的問題：

TIL細(xì)胞的優(yōu)點很多：①可直接從病人活何檢標(biāo)本，腫瘤引流的淋巴結(jié)以及 胸腹水中提出，從而避免了由病人外周血制備，因此更適合體質(zhì)虛弱的病人；②TIL細(xì)胞可長期擴(kuò)增，增殖力超過LAK細(xì)胞，容易達(dá)到治療所需的細(xì)胞數(shù)量；③TIL細(xì)胞特異性及抗癌活性高，不損害其它正常細(xì)胞；④對IL-2依賴性低，免于使用大量IL-2帶來的副作用；⑤大劑量使用時，一般可以耐受，很少毒副作用；⑥配合化療，可增強(qiáng)TIL細(xì)胞的體內(nèi)療效，上術(shù)優(yōu)點均為LAK細(xì)胞所不及。

TIL細(xì)胞只能應(yīng)用同系動物或自體的淋巴細(xì)胞。制備步驟復(fù)雜，有待進(jìn)一步改進(jìn)，與其它淋巴因子的關(guān)系以及在體內(nèi)殺傷瘤細(xì)胞的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之，TIL細(xì)胞目前不失為一種有效的治療腫瘤的措施之一，臨床療效，特別在胃癌方面的療效需要進(jìn)一步擴(kuò)大驗證。

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