2016年10月05日訊 人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與人類疾病有關(guān)的單核苷酸變異,其中許多是功能獲得性突變,會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸置換或者形成轉(zhuǎn)錄因子的新結(jié)合位點。然而現(xiàn)有篩選方法(包括CRISPR、CRISPRi和RNAi)只能破壞一個基因或者改變其表達水平,難以引入一系列功能獲得性突變進行高通量篩選,亟需能有效作用于哺乳動物細胞的遺傳多樣化工具。
中科院上海生命科學院/上海交大醫(yī)學院健康科學研究所的研究團隊在Nature Methods雜志上發(fā)表了一項重要研究成果。他們將活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶(AID)與CRISPR-dCas9融合起來,打造了有效的遺傳多樣化工具,以便對功能性變異進行高通量篩選。這篇文章的通訊作者是健康科學研究所的常興(Xing Chang)研究員。
細菌一直在與病毒或入侵核酸進行斗爭,為此它們演化出了多種防御機制,CRISPR-Cas9適應(yīng)性免疫系統(tǒng)就是其中之一。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合,可以在引導(dǎo)RNA的指引下,靶標并切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點,將CRISPR系統(tǒng)制成了強大的基因組編輯工具。該系統(tǒng)使用簡單而且擴展性強,很快便受到了研究者們的廣泛歡迎。
喪失核酸酶活性的dCas9依然可以到達目的地,只是無法進行剪切。研究顯示,dCas9-AIDx會在sgRNA的引導(dǎo)下把胞嘧啶或鳥嘌呤直接變成其它堿基,在指定位點形成一系列變異。與尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑聯(lián)合使用,dCas9-AIDx能將胞嘧啶特異性轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,制造特定點突變。
研究人員在慢性粒細胞白血病細胞中用dCas9-AIDx靶標BCR-ABL,有效鑒定了賦予細胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變。研究表明,dCas9-AIDx是一種相當實用的遺傳學工具,可以在單堿基水平上篩選功能獲得性變異。
上個月Nature Methods雜志同時發(fā)表了兩篇精彩的CRISPR研究論文。其中,深圳大學第一附屬醫(yī)院深圳市第二人民醫(yī)院開發(fā)的CRISPR“信號傳導(dǎo)器”特別引人注目。深圳大學的研究人員給sgRNA帶上能識別特定信號的改良版核糖開關(guān),構(gòu)建了基于CRISPR-Cas9的“信號傳導(dǎo)器”。這種“信號傳導(dǎo)器”可以根據(jù)外界或內(nèi)部信號調(diào)控內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄,實現(xiàn)對細胞信號通路和復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的定向控制。
PRKAG2心臟綜合征是由PRKAG2基因突變造成的常染色體顯性遺傳疾病。武漢大學、中科院和復(fù)旦大學的研究人員建立了PRKAG2心臟綜合征小鼠模型,并通過CRISPR/Cas9基因組編輯成功校正了小鼠的PRKAG2突變。這項研究于八月三十日發(fā)表在Cell Research雜志上。
內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以成為強大的DNA編輯工具,比如ZFN、TALEN、風頭正勁的CRISPR-Cas系統(tǒng)和充滿爭議的NgAgo技術(shù)。不過這些技術(shù)都是通過序列識別來實現(xiàn)靶向切割的,會受到序列偏好的限制。南京大學的研究團隊九月十五日在Genome Biology雜志上發(fā)表了一項突破性成果。他們開發(fā)了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的DNA編輯新技術(shù),不再受到靶序列的限制。
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