Nature,Methods：中國學(xué)者發(fā)現(xiàn)DNA堿基編輯新方法(分子生物學(xué)進(jìn)展)

Nature,Methods：中國學(xué)者發(fā)現(xiàn)DNA堿基編輯新方法

2016年10月05日訊 國際學(xué)術(shù)期刊《自然-方法》（Nature Methods）在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所常興研究組題為Targeted AID -mediated mutagenesis （TAM） enablesefficient genomic diversification in mammalian cells 的最新研究成果，報(bào)道了利用靶向性胞嘧啶脫氨酶在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效率和高通量的DNA堿基編輯的新方法。

單核苷酸的多樣性是遺傳多樣性的主要來源，是分子進(jìn)化的動力和很多疾病的直接誘因。然而由于哺乳動物基因組的高度穩(wěn)定性，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)很難高效和高通量地誘導(dǎo)單核苷酸的突變，進(jìn)而研究這些突變的功能。雖然通過CRISPR等基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)較高效的DNA切割和基因敲除，但由于同源重組（HDR）的效率低下，現(xiàn)有的CRISPR技術(shù)對于體內(nèi)構(gòu)建單核苷酸突變?nèi)蕴幱诘托щA段。

靶向性AID介導(dǎo)的核苷酸突變（TAM）這種新的研究方法，有可能改變這一現(xiàn)狀。有別于絕大多數(shù)體細(xì)胞基因組，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中可以進(jìn)行高效編輯，對抗原受體進(jìn)行高效突變，產(chǎn)生近乎無限的抗原受體庫，用以抵御可能的病原體入侵。受這一“突變自我”機(jī)制的啟發(fā)，博士研究生馬云青和張佳元在研究員常興的指導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把核酸酶缺陷的Cas9蛋白和誘導(dǎo)抗體高頻突變的胞嘧啶脫氨酶AID融合后，在sgRNA靶向的基因組DNA上，胞嘧啶和鳥嘌呤可以隨機(jī)地向其它三個(gè)堿基轉(zhuǎn)變。

這一新方法可以對細(xì)胞內(nèi)的特定DNA序列進(jìn)行多樣化，完成遺傳篩選，從而分析單核苷酸突變的功能。同時(shí)在一種多肽抑制劑的輔助下，dCas9-AID可以誘導(dǎo)特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶轉(zhuǎn)變，實(shí)現(xiàn)單堿基的精確編輯。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證明，利用這一方法可以快速有效地模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)耐藥機(jī)制的異質(zhì)性，預(yù)測可能的腫瘤耐藥性突變，進(jìn)而改良小分子抑制劑和研究小分子與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的相互作用。該研究成果為分子進(jìn)化、基因治療和在單堿基水平上分析基因調(diào)控元件等領(lǐng)域提供新的方法。

分子生物學(xué)進(jìn)展

科學(xué)領(lǐng)域中任何一門學(xué)科的形成和發(fā)展，一般很難準(zhǔn)確地說明它是何時(shí)、何人創(chuàng)始的。分子生物學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展，同其它學(xué)科一樣，經(jīng)歷了漫長而艱辛的過程，逐步走向成熟而迅速發(fā)展的道路。
1871年，Lankester就提出，生物不同種屬間的化學(xué)和分子差異的發(fā)現(xiàn)和分析，對確定系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系，要比總體形態(tài)學(xué)的比較研究更為重要。后來，隨著德國、美國生理化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的
建立和生物化學(xué)雜志的創(chuàng)辦，促進(jìn)了生物化學(xué)的發(fā)展。當(dāng)生物化學(xué)深入到研究生物大分子時(shí)，
1938年Weaver在寫給洛克菲勒基金會的報(bào)告中，首次使用了分子生物學(xué)(molecular biology)一詞。他寫道：“在基金會給予支持的研究中，有一系列屬于比較新的領(lǐng)域，可稱之為分子生物學(xué)……”。一年以后，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的Astbury使用了這個(gè)名詞，以后它變得越來越普遍。特別是在1953年，Watson和Crick發(fā)表了著名論文“脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)”以后，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了遺傳學(xué)、生物化學(xué)和生物物理學(xué)的結(jié)合，推動了分子生物學(xué)的形成和迅速發(fā)展，使生命科學(xué)全面地進(jìn)入分子水平研究的時(shí)代，這是生物科學(xué)發(fā)展史上的重大里程碑。1956年劍橋醫(yī)學(xué)研究委員會率先建立了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，1959年創(chuàng)刊了《分子生物學(xué)》雜志，1963年成立了歐洲分子生物學(xué)國際組織，分子生物學(xué)從而成為嶄新的獨(dú)立學(xué)科，帶動著生命科學(xué)迅猛發(fā)展，成為現(xiàn)代自然科學(xué)研究中的重要領(lǐng)域。
在分子生物學(xué)的形成和發(fā)展過程中，有許多重大的發(fā)現(xiàn)和事件，具體情況如下：
1864年：Hoope-Seyler結(jié)晶并命名了血紅蛋白。
1869年：Mieseher第一次分離了DNA。
1871年：Lankester首先提出生物不同種屬間的化學(xué)和分子差異的發(fā)現(xiàn)與分析，對確定系
統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系，要比總體形態(tài)學(xué)的比較研究更為重要。
1926年：Sumaer從刀豆的提取物中得到脲酶結(jié)晶，并證明此蛋白質(zhì)結(jié)晶有催化活性。同年，Svedberg創(chuàng)建了第一臺分析用超高速離心機(jī)，并用其測定了血紅蛋白的相對分子質(zhì)量約為6.8X104。
1931年：Pauling發(fā)表了他的第一篇關(guān)于“化學(xué)鍵特性”的論文，詳細(xì)說明了共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)的
規(guī)律。后來，又建立了處理生物分子的量子力學(xué)理論。
1934年：Bernal和Crowfoot發(fā)表了第一張胃蛋白酶晶體的詳盡的X-射線衍射圖譜。
1941年：Astbury獲得了第一張DNA的X-射線衍射圖譜。
1944年：Avery提供了在細(xì)菌的轉(zhuǎn)化中，攜帶遺傳信息的是DNA，而不是蛋白質(zhì)的證據(jù)。實(shí)驗(yàn)證明，使無毒的R型肺炎雙球菌轉(zhuǎn)變成致病的S型，DNA是轉(zhuǎn)化的基本要素。8年后，1952年，Hershey和Chase又用同位素示蹤技術(shù)證明T2噬菌體感染大腸桿菌，主要是核酸進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，而病毒外殼蛋白留在細(xì)胞外。煙草花葉病毒的重建實(shí)驗(yàn)證明，病毒蛋白質(zhì)的特性由RNA決定，即遺傳物質(zhì)是核酸而不是蛋白質(zhì)。至此，DNA作為遺傳物質(zhì)才被普遍地接受。
1950年：Chargaff以不同來源DNA堿基組成的精確數(shù)據(jù)推翻了四核苷酸論，提出了Chargaff規(guī)則，即DNA的堿基組成有一個(gè)共同的規(guī)律，胸腺嘧啶的摩爾含量總是等于腺嘌呤的摩爾含量，胞嘧啶的摩爾含量總是等于鳥嘌呤的摩爾含量，即[A]＝[T]和[G]＝[C]。
1951年：Pauling和Corey應(yīng)用X-射線衍射晶體學(xué)理論研究了氨基酸和多肽的精細(xì)空間結(jié)構(gòu)，提出了兩種有周期規(guī)律性的多肽結(jié)構(gòu)學(xué)說，即alpha螺旋和B-折疊理論。
1953年：這是開創(chuàng)生命科學(xué)新時(shí)代的第一年，具有里程碑意義的是Watson和Crick發(fā)表了“脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)”的著名論文，他們在Franklin和Wilkins X-射線衍射研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，推導(dǎo)出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式，開創(chuàng)了生物科學(xué)的新紀(jì)元。同年，Sanger歷經(jīng)8年的研究，完成了第一個(gè)蛋白質(zhì)一胰島素的氨基酸全序列分析。
隨后，1954年Gamnow從理論上研究了遺傳密碼的編碼規(guī)律；1956年Volkin和Astrachan發(fā)現(xiàn)了mRNA(當(dāng)時(shí)尚未用此名)；1958年，Hoagland等發(fā)現(xiàn)了tRNA在蛋白質(zhì)合成中的作用；Meselson和Stahl應(yīng)用同位素和超離心法證明DNA的半保留復(fù)制；Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。
1960年：Marmur和Dory發(fā)現(xiàn)了DNA的復(fù)性作用，確定了核酸雜交反應(yīng)的專一性和可靠性；Rich證明DNA-RNA雜交分子與核酸間的信息傳遞有關(guān)，開創(chuàng)了核酸實(shí)際應(yīng)用的先河。與此同時(shí)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面，Kendrew等得到了肌紅蛋白0.2nm分辨率的結(jié)構(gòu)，Perutz等得到了血紅蛋白0.55nm分辨率的結(jié)構(gòu)。
1961年：這是分子生物學(xué)發(fā)展不平凡的一年。Jacob和Monod提出操縱子學(xué)說，發(fā)表了蛋白質(zhì)合成中遺傳調(diào)節(jié)機(jī)理的論文，此論文被譽(yù)為是分子生物學(xué)中文筆優(yōu)美的經(jīng)典論文之一。同年，Brenner等獲得mRNA的證據(jù)；Hall和Spiegelman證明T2 DNA和T2專一性RNA的序列互補(bǔ)；Crick等證明了遺傳密碼的通用性。
1962年：Arber提出第一個(gè)證據(jù)，證明限制性核酸內(nèi)切酶的存在，導(dǎo)致以后對該類酶的純
化，并由Nathans和Smith應(yīng)用于DNA圖譜和序列分析。
1965年：Holley等采用重疊法首先測定了酵母丙氨酰-tRNA的一級結(jié)構(gòu)，為廣泛、深入地研究tRNA的高級結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。
1967年：Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，該酶將具有相同粘末端或者平末端的DNA片段連接在一起。同年，Philips及其同事確定了溶菌酶0.2nm分辨率的三維結(jié)構(gòu)。
1970年：Temin和Baltimore幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，證實(shí)了Temin 1964年提出的“前
病毒假說”。在勞氏肉瘤病毒(RSV)感染以后，首先產(chǎn)生的是含有RNA病毒基因組全部遺傳信息的DNA前病毒，子代病毒的RNA是以前病毒的DNA為模板進(jìn)行合成的。反轉(zhuǎn)錄酶已成為目前分子生物學(xué)研究中的一個(gè)重要工具。
1972年～1973年：重組DNA時(shí)代到來。Berg、Boyer和Cohen等創(chuàng)建了DNA克隆化技術(shù)，在體外構(gòu)建成具有生物學(xué)功能的細(xì)菌質(zhì)粒，開創(chuàng)了基因工程新紀(jì)元。與此同時(shí)，Singer和Nicolson提出生物膜結(jié)構(gòu)的液態(tài)鑲嵌模型。
1975年：Southern發(fā)明了凝膠電泳分離DNA片段的印跡法；Gruustein和Hogness建立了克隆特定基因的新方法；O'Farrell發(fā)明了雙向電泳分析蛋白質(zhì)的方法，為分子生物學(xué)的深入發(fā)展創(chuàng)造了重要的技術(shù)條件；Blobel等報(bào)導(dǎo)了信號肽。
1976年：Bishop和Varmus發(fā)現(xiàn)動物腫瘤病毒的癌基因來源于細(xì)胞基因(即原癌基因)。
1977年：Berget等發(fā)現(xiàn)了“斷裂”基因；Sanger、Maxam和Gilbert創(chuàng)立了“酶法”“化學(xué)法”測定DNA序列的方法，標(biāo)志著分子生物學(xué)研究新時(shí)代的到來。
1979年：Solomon和Bodmer最先提出至少200個(gè)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)可作為連接人整個(gè)基因組圖譜之基礎(chǔ)。
1980年：Wigler等通過與某個(gè)選擇性標(biāo)志物共感染，從而把非選擇性基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞；Cohen和Boyer獲得一項(xiàng)克隆技術(shù)的美國專利。
1981年：Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲26S rRNA前體的自我剪接作用，隨后又證明前體中的居間序列(intervening sequence，IVS)有五種酶的活力。幾乎在同時(shí)，Altman從純化的RNase P中，證明催化tRNA前體成熟的催化劑是RNase P中的RNA。具有催化作用RNA(ribozyme)的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了RNA研究的飛速發(fā)展。
1982年：Prusiner等在感染搔癢病的倉鼠腦中發(fā)現(xiàn)了朊病毒(prion)。
1983年：Herrera-Estrella等用Ti質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得成功。
1984年：McGinnis等發(fā)現(xiàn)果蠅、非洲爪蟾等同源異形基因中的同源異形盒(homeobox)的
核苷酸序列；Schwartz和Cantor發(fā)明了脈沖梯度凝膠電泳法；Simons和Kleckner等發(fā)現(xiàn)了反義RNA。
1985年：Saiki等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；Sinsheimer首先提出人類基因組圖譜制
作計(jì)劃的設(shè)想；Smith等報(bào)導(dǎo)了DNA測序中應(yīng)用熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記的方法；Miller等發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)。
1986年：Dryja等發(fā)現(xiàn)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)基因是一種抑癌基因；Robin等采用X-光晶相學(xué)，證實(shí)了DNA結(jié)合蛋白的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。
1987年：Mirkin等在酸性溶液的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)三鏈DNA；Burke等用酵母人工染色體(YAC)作載體克隆了大片段DNA；Hoffman等確定了Dnchenne肌肉萎縮病灶的蛋白產(chǎn)物是萎縮素(dystrophin)；Hooper等和Kuehn等分別用胚基細(xì)胞進(jìn)行哺乳動物胚的轉(zhuǎn)基因操作，取得重大進(jìn)展。
1988年：Landsehalz等在對CyC3(細(xì)胞色素C基因調(diào)節(jié)蛋白)、癌基因產(chǎn)物(MyC、V-jun、V-fos)和CBP(CCAAT盒結(jié)合蛋白)的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了結(jié)合區(qū)亮氨酸序列的周期性，提出DNA結(jié)合蛋白的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)模型；同年，Whyfe等證明癌的發(fā)生是癌基因的激活和抑癌基因失活的結(jié)果。
1989年：Greider等首先在纖毛原生動物中發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase)是以內(nèi)源性RNA為模板的反轉(zhuǎn)錄酶；Hiatt等首次報(bào)導(dǎo)了在植物中亦可產(chǎn)生單克隆抗體。
1990年：人類基因組計(jì)劃(HGP)全面正式啟動；Simpson等發(fā)現(xiàn)了對mRNA前體編輯起指導(dǎo)作用的小分子RNA(guide RNA)；Sinclair等在人類Y染色體上發(fā)現(xiàn)了新的性別決定基因-SRY基因。
1991年：由歐洲共同體(EC)組織17個(gè)國家35個(gè)實(shí)驗(yàn)室的147位科學(xué)家，以手工測序?yàn)橹饕侄危紫韧瓿闪说谝粭l完整染色體(酵母3號染色體)的315kb的測序工作；Hake等首次報(bào)導(dǎo)在植物中發(fā)現(xiàn)含有同源異形盒基因；Blackburn等提出調(diào)節(jié)聚合序列[通式為(T/A)mGn，m＝124，n＝1~8]的單鏈DNA可形成分子內(nèi)或分子間的四螺旋結(jié)構(gòu)，起著穩(wěn)定染色體的作用。
1993年：Jurnak等在研究果膠酸裂解酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-平行B螺旋(parallel B helix)；Yuan等在哺乳類細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡并具有剪切作用的蛋白質(zhì)-IL-1B轉(zhuǎn)換酶(interlukin-1B-convertingenzyme，ICE)。
1994年：日本科學(xué)家在((Nature Genetics》上發(fā)表了水稻基因組遺傳圖；Wilson等用3年
時(shí)間完成了線蟲(Celegans)3號染色體連續(xù)的2.2Mb的測定，預(yù)示著百萬堿基規(guī)模的DNA序列測定時(shí)代的到來。
1995年：Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA；Tu等在E.coli中發(fā)現(xiàn)了具有轉(zhuǎn)運(yùn)與信使雙功能的RNA-10 Sa RNA。
1996年：Lee等首次報(bào)導(dǎo)了酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4中的氨基酸片段能自動催化合成自我復(fù)制的肽；洪國藩等采用“指紋-錨標(biāo)”戰(zhàn)略構(gòu)建了高分辨率的水稻基因組物理圖譜，DNA片段的長度為120kb；Goffeau等完成了酵母基因組DNA全序列(1.25X10 7bp)的測定。
1997年：Wilmut等首次不經(jīng)過受精，用成年母羊體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，成功地獲得克隆羊-多莉(Dolly)；Willard等首次構(gòu)建了人染色體(HACs)；Salishury等發(fā)現(xiàn)DNA一種新的結(jié)構(gòu)形式-四顯性組合，這可能是基因交換期間DNA聯(lián)結(jié)的一種方式。
1998年：Renard等用體細(xì)胞操作獲得克隆牛-Marguerife，再次證明從體細(xì)胞可克隆出遺傳上完全相同的哺乳動物；GeneBank公布了最新人的“基因圖譜98'’，代表了30181條基因定位的信息；Venter對人類基因組計(jì)劃提出新的戰(zhàn)略-全基因組隨機(jī)測序，毛細(xì)管電泳測序儀啟動。
從以上所述分子生物學(xué)的發(fā)展中，可以看出20世紀(jì)是以核酸的研究為核心，帶動著分子生物學(xué)向縱深發(fā)展。50年代的雙螺旋結(jié)構(gòu)，60年代的操縱子學(xué)說，70年代的DNA重組，80年代的PCR技術(shù)，90年代的DNA測序都具有里程碑的意義，將生命科學(xué)帶向一個(gè)由宏觀到微觀再到宏觀，由分析到綜合的時(shí)代。

什么是克?。?/span>

克隆”是從英文“clone”音譯而來，在生物學(xué)領(lǐng)域有3個(gè)不同層次的含義。

1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術(shù)插入到一個(gè)載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。

2．在細(xì)胞水平，克隆實(shí)質(zhì)由一個(gè)單一的共同祖先細(xì)胞分裂所形成的一個(gè)細(xì)胞群體。其中每個(gè)細(xì)胞的基因都相同。比如，使一個(gè)細(xì)胞在體外的培養(yǎng)液中分裂若干代所形成的一個(gè)遺傳背景完全相同的細(xì)胞集體即為一個(gè)細(xì)胞克隆。又如，在脊椎動物體內(nèi)，當(dāng)有外源物(如細(xì)菌或病毒)侵入時(shí)，會通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異的識別抗體。產(chǎn)生某一特定抗體的所有漿細(xì)胞都是由一個(gè)B細(xì)胞分裂而成，這樣的一個(gè)漿細(xì)胞群體也是一個(gè)細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆是一種低級的生殖方式－無性繁殖，即不經(jīng)過兩性結(jié)合，子代和親代具有相同的遺傳性。生物進(jìn)化的層次越低，越有可能采取這種繁殖方式。

3．在個(gè)體水平，克隆是指基因型完全相同的兩個(gè)或更多的個(gè)體組成的一個(gè)群體。比如，兩個(gè)同卵雙胞胎即為一個(gè)克?。∫?yàn)樗ㄋ﹤儊碜酝粋€(gè)卵細(xì)胞，所以遺傳背景完全一樣。按此定義，“多利”并不能說成是一個(gè)克?。∫?yàn)椤岸嗬敝皇枪聠蔚囊粋€(gè)。只有當(dāng)那些英國胚胎學(xué)家能將兩個(gè)以上完全相同的細(xì)胞核移植到兩個(gè)以上完全相同的去核卵細(xì)胞中，得到兩個(gè)以上遺傳背景完全相同的“多利”時(shí)才能用克隆這個(gè)詞來描述。所以在那篇發(fā)表于1997年2月出版在《Nature》雜志上的轟動性論文中，作者并沒有把“多利”說成是一個(gè)克隆。

另外，克隆也可以做動詞用，意思是指獲得以上所言DNA、細(xì)胞或個(gè)體群體的過程。

二、克隆技術(shù)

1．DNA克隆

現(xiàn)在進(jìn)行DNA克隆的方法多種多樣，其基本過程如下圖所示(未按比例)

可見，這樣得到的DNA可以應(yīng)用于生物學(xué)研究的很多方面，包括對特異DNA的堿基順序的分析和處理，以及生物技術(shù)工業(yè)中有價(jià)值蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)等等。

2．生物個(gè)體的克隆

(1)植物個(gè)體的克隆

在20世紀(jì)50年代，植物學(xué)家用胡蘿卜為模型材料，研究了分化的植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)是否丟失問題，他們驚奇地發(fā)現(xiàn)，從一個(gè)單一已經(jīng)高度分化的胡蘿卜細(xì)胞

可以發(fā)育形成一棵完整的植株!由此，他們認(rèn)為植物細(xì)胞具有全能性。從一棵胡蘿卜中的兩個(gè)以上的體細(xì)胞發(fā)育而成的胡蘿卜群體的遺傳背景完全一樣，故為一個(gè)克隆。如此的植物的克隆過程是一個(gè)完全的無性繁殖過程!

(2)動物個(gè)體的克隆

① “多利”的誕生

1997年2月27日英國愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩·維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動了全世界。

“多莉”的產(chǎn)生與三只母羊有關(guān)。一只是懷孕三個(gè)月的芬蘭多塞特母綿羊，兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。芬蘭多塞特母綿羊提供了全套遺傳信息，即提供了細(xì)胞核（稱之為供體）；一只蘇格蘭黑面母綿羊提供無細(xì)胞核的卵細(xì)胞；另一只蘇格蘭黑面母綿羊提供羊胚胎的發(fā)育環(huán)境——子宮，是“多莉”羊的“生”母。其整個(gè)克隆過程簡述如下：

從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止了分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞；給一頭蘇格蘭黑面母綿羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將其細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞；利用電脈沖的方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞發(fā)生融合，最后形成了融合細(xì)胞，由于電脈沖還可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能象受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞；將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。出生的“多莉”小綿羊與多塞特母綿羊具有完全相同的外貌。

一年以后，另一組科學(xué)家報(bào)道了將小鼠卵丘細(xì)胞(圍繞在卵母細(xì)胞外周的高度分化細(xì)胞)的細(xì)胞核移植到去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中得到20多只發(fā)育完全的小鼠。如呆“多利”因?yàn)橹挥幸恢唬€不夠叫做克隆羊的話，這些小鼠

就是名副其實(shí)的克隆鼠了。

② 通過細(xì)胞核移植克隆小鼠的基本過程

在本實(shí)驗(yàn)中，卵丘細(xì)胞是經(jīng)如下過程得到的：通過連續(xù)幾次注射絨毛膜促性腺激素，使雌鼠誘導(dǎo)成高產(chǎn)卵量狀態(tài)。然后從雌鼠輸卵管中收集卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的復(fù)合體。經(jīng)透明質(zhì)酸處理使卵丘細(xì)胞散開。選擇直徑為10－12微米的卵丘細(xì)胞用作細(xì)胞核供體（前期實(shí)驗(yàn)表明，若用直徑更小或更大的卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，經(jīng)過細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞很少發(fā)育到8細(xì)胞期）。所選擇的卵丘細(xì)胞保持在一定的溶液環(huán)境中，在3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞核移植（與此不同的是，在獲得“多利”時(shí)用作細(xì)胞核供體的乳腺細(xì)胞先在培養(yǎng)液中傳代了3－6次）

卵母細(xì)胞（一般處于減數(shù)分裂中期 II ）通過與上面描述類似的方法，從不同種的雌鼠中收集。在顯微鏡下小心地用直徑大約7微米的細(xì)管取出卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，盡量不取出細(xì)胞質(zhì)。同樣小心取出卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，也盡量去除所帶的細(xì)胞質(zhì)（通過使取出的細(xì)胞核在玻璃管中往復(fù)運(yùn)動數(shù)次，以去除所帶的少量的細(xì)胞質(zhì)）。在細(xì)胞核被取出后5分鐘之內(nèi)，直接注射到已經(jīng)去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中。進(jìn)行了細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞先放在一種特制的溶液中1－6小時(shí)，然后加入二價(jià)的鍶離子（Sr2+）和細(xì)胞分裂抑素B。前者使卵母細(xì)胞激活，后者抑制極體的形成和染色體的排除。再取出處理過的卵母細(xì)胞，放在沒有鍶和細(xì)胞分裂抑素B的特制的溶液中使細(xì)胞分裂形成胚胎。

不同階段的胚胎（從2細(xì)胞期到胚泡期）被分別植入幾天前與已經(jīng)結(jié)扎雄鼠交配過的假孕母鼠的輸卵管或子宮中發(fā)育。發(fā)育完全的胎兒鼠在大約19天后通過手術(shù)取出。

目前胚胎細(xì)胞核移植克隆的動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴子等。在中國，除猴子以外，其他克隆動物都有，也能連續(xù)核移植克隆山羊，該技術(shù)比胚胎分割技術(shù)更進(jìn)一步，將克隆出更多的動物。因胚胎分割次數(shù)越多，每份細(xì)胞越少，發(fā)育成的個(gè)體的能力越差。體細(xì)胞核移植克隆的動物只有一個(gè)，就是“多利”羊。

三、克隆技術(shù)的福音

1． 克隆技術(shù)與遺傳育種

在農(nóng)業(yè)方面，人們利用“克隆”技術(shù)培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病蟲害的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種，大大提高了糧食產(chǎn)量。在這方面我國已邁入世界最先進(jìn)的前列。

2． 克隆技術(shù)與瀕危生物保護(hù)

克隆技術(shù)對保護(hù)物種特別是珍稀、瀕危物種來講是一個(gè)福音，具有很大的應(yīng)用前景。從生物學(xué)的角度看，這也是克隆技術(shù)最有價(jià)值的地方之一。

3． 克隆技術(shù)與醫(yī)學(xué)

在當(dāng)代，醫(yī)生幾乎能在所有人類器官和組織上施行移植手術(shù)。但就科學(xué)技術(shù)而言，器官移植中的排斥反應(yīng)仍是最為頭痛的事。排斥反應(yīng)的原因是組織不配型導(dǎo)致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供給“原版人”，作器官移植之用，則絕對沒有排斥反應(yīng)之慮，因?yàn)槎呋蛳嗯?，組織也相配。問題是，利用“克隆人”作為器官供體合不合乎人道？是否合法？經(jīng)濟(jì)是否合算？

克隆技術(shù)還可用來大量繁殖有價(jià)值的基因，例如，在醫(yī)學(xué)方面，人們正是通過“克隆”技術(shù)生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素、使侏儒癥患者重新長高的生長激素和能抗多種病毒感染的干撓素，等等。
克隆技術(shù)即無性繁殖技術(shù)。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子結(jié)合發(fā)育成胚胎，經(jīng)妊娠后產(chǎn)出新的個(gè)體。克隆技術(shù)不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的結(jié)合，只需從動物身上提取一個(gè)單細(xì)胞，用人工的方法將其培養(yǎng)成胚胎，再將胚胎植入雌性動物體內(nèi)，就可孕育出新的個(gè)體。這種以單細(xì)胞培養(yǎng)出來的克隆動物，具有與單細(xì)胞供體完全相同的特征，是單細(xì)胞供體的“復(fù)制品”。英國英格蘭科學(xué)家和美國俄勒岡科學(xué)家先后培養(yǎng)出了“克隆羊”和“克隆猴”?？寺〖夹g(shù)的成功，被人們稱為“歷史性的事件，科學(xué)的創(chuàng)舉”。有人甚至認(rèn)為，克隆技術(shù)可以同當(dāng)年原子彈的問世相提并論。

克隆技術(shù)可以用來生產(chǎn)“克隆人”，可以用來“復(fù)制”人，因而引起了全世界的廣泛關(guān)注。對人類來說，克隆技術(shù)是悲是喜，是禍?zhǔn)歉?？唯物辯證法認(rèn)為，世界上的任何事物都是矛盾的統(tǒng)一體，都是一分為二的。克隆技術(shù)也是這樣。如果克隆技術(shù)被用于“復(fù)制”像希特勒之類的戰(zhàn)爭狂人，那會給人類社會帶來什么呢？即使是用于“復(fù)制”普通的人，也會帶來一系列的倫理道德問題。如果把克隆技術(shù)應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，將會使優(yōu)良牲畜品種的培育與繁殖發(fā)生根本性的變革。若將克隆技術(shù)用于基因治療的研究，就極有可能攻克那些危及人類生命健康的癌癥、艾滋病等頑疾。克隆技術(shù)猶如原子能技術(shù)，是一把雙刃劍，劍柄掌握在人類手中。人類應(yīng)該采取聯(lián)合行動，避免“克隆人”的出現(xiàn)，使克隆技術(shù)造福于人類社會。
克隆（clone）是指通過無性生殖而產(chǎn)生的遺傳上均一的生物群，即具有完全相同的遺傳組成的一群細(xì)胞或者生物的個(gè)體?？寺≡谙ＥD語中是“小樹枝葉”的意思，用以指無性增殖物?，F(xiàn)在則指個(gè)體、細(xì)胞、基因等不同水平上的無性增殖物。（1）個(gè)體水平：在植物的無性增殖中，植物的發(fā)芽、插條等由同一個(gè)體通過無性生殖而增長的個(gè)體群均被視為克隆。采用組織培養(yǎng)方法可使植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)育成完全的個(gè)體（愈傷組織），采用這種方法得到的具有相同基因型的個(gè)體群，也被稱為克隆；在動物的無性增殖中，典型的例子是采用核移植實(shí)驗(yàn)方法，把分化細(xì)胞的核移植到一個(gè)事先去核的蛙卵中，讓其發(fā)育并得到克隆蛙。克隆動物具有均一遺傳性質(zhì)，在研究環(huán)境條件對發(fā)育、分化的影響以及藥物的檢測方面都是重要的實(shí)驗(yàn)材料。在哺乳動物中，由于細(xì)胞分化，核異質(zhì)化的程度加劇，因此核移植尚無成功的例子。（2）細(xì)胞水平：由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂生成的細(xì)胞群叫克隆。但如果培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，則很容易引起染色體變異。（3）基因水平：利用基因重組操作技術(shù)，使特定的基因與載體結(jié)合，在細(xì)菌等宿主中進(jìn)行增殖，有可能得到均勻的基因群?？寺』蛟诨蚬δ芘c精細(xì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系等基礎(chǔ)研究及在有用物質(zhì)的生產(chǎn)方面，均已得到應(yīng)用。
在上述3種水平上，增殖并分離獲得單一的克隆群稱為克隆化。此時(shí)，克隆一詞也可作為動詞理解。克隆是重組DNA技術(shù)的核心部分。事實(shí)上，克隆技術(shù)現(xiàn)已被人們用來通過營養(yǎng)方式繁殖病毒等微生物和植物的純種，從而保證了這些生物基因組的準(zhǔn)確連續(xù)性。現(xiàn)在，克隆這個(gè)詞還包括單個(gè)自主遺傳因子的分離與保存。細(xì)胞生物的克隆只需要營養(yǎng)培養(yǎng)基，而基因的克隆則需要某種載體復(fù)制子、特定的寄主細(xì)胞和營養(yǎng)培養(yǎng)基。各種類型生物的克隆技術(shù)在生物工程中均有其重要作用。
克隆”是從英文“clone”音譯而來，在生物學(xué)領(lǐng)域有3個(gè)不同層次的含義。

1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術(shù)插入到一個(gè)載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。

2．在細(xì)胞水平，克隆實(shí)質(zhì)由一個(gè)單一的共同祖先細(xì)胞分裂所形成的一個(gè)細(xì)胞群體。其中每個(gè)細(xì)胞的基因都相同。比如，使一個(gè)細(xì)胞在體外的培養(yǎng)液中分裂若干代所形成的一個(gè)遺傳背景完全相同的細(xì)胞集體即為一個(gè)細(xì)胞克隆。又如，在脊椎動物體內(nèi)，當(dāng)有外源物(如細(xì)菌或病毒)侵入時(shí)，會通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異的識別抗體。產(chǎn)生某一特定抗體的所有漿細(xì)胞都是由一個(gè)B細(xì)胞分裂而成，這樣的一個(gè)漿細(xì)胞群體也是一個(gè)細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆是一種低級的生殖方式－無性繁殖，即不經(jīng)過兩性結(jié)合，子代和親代具有相同的遺傳性。生物進(jìn)化的層次越低，越有可能采取這種繁殖方式。

3．在個(gè)體水平，克隆是指基因型完全相同的兩個(gè)或更多的個(gè)體組成的一個(gè)群體。比如，兩個(gè)同卵雙胞胎即為一個(gè)克??！因?yàn)樗ㄋ﹤儊碜酝粋€(gè)卵細(xì)胞，所以遺傳背景完全一樣。按此定義，“多利”并不能說成是一個(gè)克??！因?yàn)椤岸嗬敝皇枪聠蔚囊粋€(gè)。只有當(dāng)那些英國胚胎學(xué)家能將兩個(gè)以上完全相同的細(xì)胞核移植到兩個(gè)以上完全相同的去核卵細(xì)胞中，得到兩個(gè)以上遺傳背景完全相同的“多利”時(shí)才能用克隆這個(gè)詞來描述。所以在那篇發(fā)表于1997年2月出版在《Nature》雜志上的轟動性論文中，作者并沒有把“多利”說成是一個(gè)克隆。

另外，克隆也可以做動詞用，意思是指獲得以上所言DNA、細(xì)胞或個(gè)體群體的過程。

二、克隆技術(shù)

1．DNA克隆

現(xiàn)在進(jìn)行DNA克隆的方法多種多樣，其基本過程如下圖所示(未按比例)

可見，這樣得到的DNA可以應(yīng)用于生物學(xué)研究的很多方面，包括對特異DNA的堿基順序的分析和處理，以及生物技術(shù)工業(yè)中有價(jià)值蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)等等。

2．生物個(gè)體的克隆

(1)植物個(gè)體的克隆

在20世紀(jì)50年代，植物學(xué)家用胡蘿卜為模型材料，研究了分化的植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)是否丟失問題，他們驚奇地發(fā)現(xiàn)，從一個(gè)單一已經(jīng)高度分化的胡蘿卜細(xì)胞

可以發(fā)育形成一棵完整的植株!由此，他們認(rèn)為植物細(xì)胞具有全能性。從一棵胡蘿卜中的兩個(gè)以上的體細(xì)胞發(fā)育而成的胡蘿卜群體的遺傳背景完全一樣，故為一個(gè)克隆。如此的植物的克隆過程是一個(gè)完全的無性繁殖過程!

(2)動物個(gè)體的克隆

① “多利”的誕生

1997年2月27日英國愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩·維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動了全世界。

“多莉”的產(chǎn)生與三只母羊有關(guān)。一只是懷孕三個(gè)月的芬蘭多塞特母綿羊，兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。芬蘭多塞特母綿羊提供了全套遺傳信息，即提供了細(xì)胞核（稱之為供體）；一只蘇格蘭黑面母綿羊提供無細(xì)胞核的卵細(xì)胞；另一只蘇格蘭黑面母綿羊提供羊胚胎的發(fā)育環(huán)境——子宮，是“多莉”羊的“生”母。其整個(gè)克隆過程簡述如下：

從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止了分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞；給一頭蘇格蘭黑面母綿羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將其細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞；利用電脈沖的方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞發(fā)生融合，最后形成了融合細(xì)胞，由于電脈沖還可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能象受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞；將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。出生的“多莉”小綿羊與多塞特母綿羊具有完全相同的外貌。

一年以后，另一組科學(xué)家報(bào)道了將小鼠卵丘細(xì)胞(圍繞在卵母細(xì)胞外周的高度分化細(xì)胞)的細(xì)胞核移植到去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中得到20多只發(fā)育完全的小鼠。如呆“多利”因?yàn)橹挥幸恢?，還不夠叫做克隆羊的話，這些小鼠

就是名副其實(shí)的克隆鼠了。

② 通過細(xì)胞核移植克隆小鼠的基本過程

在本實(shí)驗(yàn)中，卵丘細(xì)胞是經(jīng)如下過程得到的：通過連續(xù)幾次注射絨毛膜促性腺激素，使雌鼠誘導(dǎo)成高產(chǎn)卵量狀態(tài)。然后從雌鼠輸卵管中收集卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的復(fù)合體。經(jīng)透明質(zhì)酸處理使卵丘細(xì)胞散開。選擇直徑為10－12微米的卵丘細(xì)胞用作細(xì)胞核供體（前期實(shí)驗(yàn)表明，若用直徑更小或更大的卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，經(jīng)過細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞很少發(fā)育到8細(xì)胞期）。所選擇的卵丘細(xì)胞保持在一定的溶液環(huán)境中，在3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞核移植（與此不同的是，在獲得“多利”時(shí)用作細(xì)胞核供體的乳腺細(xì)胞先在培養(yǎng)液中傳代了3－6次）

卵母細(xì)胞（一般處于減數(shù)分裂中期 II ）通過與上面描述類似的方法，從不同種的雌鼠中收集。在顯微鏡下小心地用直徑大約7微米的細(xì)管取出卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，盡量不取出細(xì)胞質(zhì)。同樣小心取出卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，也盡量去除所帶的細(xì)胞質(zhì)（通過使取出的細(xì)胞核在玻璃管中往復(fù)運(yùn)動數(shù)次，以去除所帶的少量的細(xì)胞質(zhì)）。在細(xì)胞核被取出后5分鐘之內(nèi)，直接注射到已經(jīng)去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中。進(jìn)行了細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞先放在一種特制的溶液中1－6小時(shí)，然后加入二價(jià)的鍶離子（Sr2+）和細(xì)胞分裂抑素B。前者使卵母細(xì)胞激活，后者抑制極體的形成和染色體的排除。再取出處理過的卵母細(xì)胞，放在沒有鍶和細(xì)胞分裂抑素B的特制的溶液中使細(xì)胞分裂形成胚胎。

不同階段的胚胎（從2細(xì)胞期到胚泡期）被分別植入幾天前與已經(jīng)結(jié)扎雄鼠交配過的假孕母鼠的輸卵管或子宮中發(fā)育。發(fā)育完全的胎兒鼠在大約19天后通過手術(shù)取出。

目前胚胎細(xì)胞核移植克隆的動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴子等。在中國，除猴子以外，其他克隆動物都有，也能連續(xù)核移植克隆山羊，該技術(shù)比胚胎分割技術(shù)更進(jìn)一步，將克隆出更多的動物。因胚胎分割次數(shù)越多，每份細(xì)胞越少，發(fā)育成的個(gè)體的能力越差。體細(xì)胞核移植克隆的動物只有一個(gè)，就是“多利”羊。

三、克隆技術(shù)的福音

1． 克隆技術(shù)與遺傳育種

在農(nóng)業(yè)方面，人們利用“克隆”技術(shù)培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病蟲害的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種，大大提高了糧食產(chǎn)量。在這方面我國已邁入世界最先進(jìn)的前列。

2． 克隆技術(shù)與瀕危生物保護(hù)

克隆技術(shù)對保護(hù)物種特別是珍稀、瀕危物種來講是一個(gè)福音，具有很大的應(yīng)用前景。從生物學(xué)的角度看，這也是克隆技術(shù)最有價(jià)值的地方之一。

3． 克隆技術(shù)與醫(yī)學(xué)

在當(dāng)代，醫(yī)生幾乎能在所有人類器官和組織上施行移植手術(shù)。但就科學(xué)技術(shù)而言，器官移植中的排斥反應(yīng)仍是最為頭痛的事。排斥反應(yīng)的原因是組織不配型導(dǎo)致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供給“原版人”，作器官移植之用，則絕對沒有排斥反應(yīng)之慮，因?yàn)槎呋蛳嗯?，組織也相配。問題是，利用“克隆人”作為器官供體合不合乎人道？是否合法？經(jīng)濟(jì)是否合算？

克隆技術(shù)還可用來大量繁殖有價(jià)值的基因，例如，在醫(yī)學(xué)方面，人們正是通過“克隆”技術(shù)生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素、使侏儒癥患者重新長高的生長激素和能抗多種病毒感染的干撓素，等等。

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克隆”是從英文“clone”音譯而來，在生物學(xué)領(lǐng)域有3個(gè)不同層次的含義。

1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術(shù)插入到一個(gè)載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。

2．在細(xì)胞水平，克隆實(shí)質(zhì)由一個(gè)單一的共同祖先細(xì)胞分裂所形成的一個(gè)細(xì)胞群體。其中每個(gè)細(xì)胞的基因都相同。比如，使一個(gè)細(xì)胞在體外的培養(yǎng)液中分裂若干代所形成的一個(gè)遺傳背景完全相同的細(xì)胞集體即為一個(gè)細(xì)胞克隆。又如，在脊椎動物體內(nèi)，當(dāng)有外源物(如細(xì)菌或病毒)侵入時(shí)，會通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異的識別抗體。產(chǎn)生某一特定抗體的所有漿細(xì)胞都是由一個(gè)B細(xì)胞分裂而成，這樣的一個(gè)漿細(xì)胞群體也是一個(gè)細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆是一種低級的生殖方式－無性繁殖，即不經(jīng)過兩性結(jié)合，子代和親代具有相同的遺傳性。生物進(jìn)化的層次越低，越有可能采取這種繁殖方式。

3．在個(gè)體水平，克隆是指基因型完全相同的兩個(gè)或更多的個(gè)體組成的一個(gè)群體。比如，兩個(gè)同卵雙胞胎即為一個(gè)克?。∫?yàn)樗ㄋ﹤儊碜酝粋€(gè)卵細(xì)胞，所以遺傳背景完全一樣。按此定義，“多利”并不能說成是一個(gè)克??！因?yàn)椤岸嗬敝皇枪聠蔚囊粋€(gè)。只有當(dāng)那些英國胚胎學(xué)家能將兩個(gè)以上完全相同的細(xì)胞核移植到兩個(gè)以上完全相同的去核卵細(xì)胞中，得到兩個(gè)以上遺傳背景完全相同的“多利”時(shí)才能用克隆這個(gè)詞來描述。所以在那篇發(fā)表于1997年2月出版在《Nature》雜志上的轟動性論文中，作者并沒有把“多利”說成是一個(gè)克隆。

另外，克隆也可以做動詞用，意思是指獲得以上所言DNA、細(xì)胞或個(gè)體群體的過程。

二、克隆技術(shù)

1．DNA克隆

現(xiàn)在進(jìn)行DNA克隆的方法多種多樣，其基本過程如下圖所示(未按比例)

可見，這樣得到的DNA可以應(yīng)用于生物學(xué)研究的很多方面，包括對特異DNA的堿基順序的分析和處理，以及生物技術(shù)工業(yè)中有價(jià)值蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)等等。

2．生物個(gè)體的克隆

(1)植物個(gè)體的克隆

在20世紀(jì)50年代，植物學(xué)家用胡蘿卜為模型材料，研究了分化的植物細(xì)胞中遺傳物質(zhì)是否丟失問題，他們驚奇地發(fā)現(xiàn)，從一個(gè)單一已經(jīng)高度分化的胡蘿卜細(xì)胞

可以發(fā)育形成一棵完整的植株!由此，他們認(rèn)為植物細(xì)胞具有全能性。從一棵胡蘿卜中的兩個(gè)以上的體細(xì)胞發(fā)育而成的胡蘿卜群體的遺傳背景完全一樣，故為一個(gè)克隆。如此的植物的克隆過程是一個(gè)完全的無性繁殖過程!

(2)動物個(gè)體的克隆

① “多利”的誕生

1997年2月27日英國愛丁堡羅斯林(Roslin)研究所的伊恩·維爾莫特科學(xué)研究小組向世界宣布，世界上第一頭克隆綿羊“多利”(Dolly)誕生，這一消息立刻轟動了全世界。

“多莉”的產(chǎn)生與三只母羊有關(guān)。一只是懷孕三個(gè)月的芬蘭多塞特母綿羊，兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。芬蘭多塞特母綿羊提供了全套遺傳信息，即提供了細(xì)胞核（稱之為供體）；一只蘇格蘭黑面母綿羊提供無細(xì)胞核的卵細(xì)胞；另一只蘇格蘭黑面母綿羊提供羊胚胎的發(fā)育環(huán)境——子宮，是“多莉”羊的“生”母。其整個(gè)克隆過程簡述如下：

從芬蘭多塞特母綿羊的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止了分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞；給一頭蘇格蘭黑面母綿羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將其細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞；利用電脈沖的方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞發(fā)生融合，最后形成了融合細(xì)胞，由于電脈沖還可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能象受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞；將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成一只小綿羊。出生的“多莉”小綿羊與多塞特母綿羊具有完全相同的外貌。

一年以后，另一組科學(xué)家報(bào)道了將小鼠卵丘細(xì)胞(圍繞在卵母細(xì)胞外周的高度分化細(xì)胞)的細(xì)胞核移植到去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中得到20多只發(fā)育完全的小鼠。如呆“多利”因?yàn)橹挥幸恢唬€不夠叫做克隆羊的話，這些小鼠

就是名副其實(shí)的克隆鼠了。

② 通過細(xì)胞核移植克隆小鼠的基本過程

在本實(shí)驗(yàn)中，卵丘細(xì)胞是經(jīng)如下過程得到的：通過連續(xù)幾次注射絨毛膜促性腺激素，使雌鼠誘導(dǎo)成高產(chǎn)卵量狀態(tài)。然后從雌鼠輸卵管中收集卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的復(fù)合體。經(jīng)透明質(zhì)酸處理使卵丘細(xì)胞散開。選擇直徑為10－12微米的卵丘細(xì)胞用作細(xì)胞核供體（前期實(shí)驗(yàn)表明，若用直徑更小或更大的卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，經(jīng)過細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞很少發(fā)育到8細(xì)胞期）。所選擇的卵丘細(xì)胞保持在一定的溶液環(huán)境中，在3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞核移植（與此不同的是，在獲得“多利”時(shí)用作細(xì)胞核供體的乳腺細(xì)胞先在培養(yǎng)液中傳代了3－6次）

卵母細(xì)胞（一般處于減數(shù)分裂中期 II ）通過與上面描述類似的方法，從不同種的雌鼠中收集。在顯微鏡下小心地用直徑大約7微米的細(xì)管取出卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，盡量不取出細(xì)胞質(zhì)。同樣小心取出卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核，也盡量去除所帶的細(xì)胞質(zhì)（通過使取出的細(xì)胞核在玻璃管中往復(fù)運(yùn)動數(shù)次，以去除所帶的少量的細(xì)胞質(zhì)）。在細(xì)胞核被取出后5分鐘之內(nèi)，直接注射到已經(jīng)去除了細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中。進(jìn)行了細(xì)胞核移植的卵母細(xì)胞先放在一種特制的溶液中1－6小時(shí)，然后加入二價(jià)的鍶離子（Sr2+）和細(xì)胞分裂抑素B。前者使卵母細(xì)胞激活，后者抑制極體的形成和染色體的排除。再取出處理過的卵母細(xì)胞，放在沒有鍶和細(xì)胞分裂抑素B的特制的溶液中使細(xì)胞分裂形成胚胎。

不同階段的胚胎（從2細(xì)胞期到胚泡期）被分別植入幾天前與已經(jīng)結(jié)扎雄鼠交配過的假孕母鼠的輸卵管或子宮中發(fā)育。發(fā)育完全的胎兒鼠在大約19天后通過手術(shù)取出。

目前胚胎細(xì)胞核移植克隆的動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛和猴子等。在中國，除猴子以外，其他克隆動物都有，也能連續(xù)核移植克隆山羊，該技術(shù)比胚胎分割技術(shù)更進(jìn)一步，將克隆出更多的動物。因胚胎分割次數(shù)越多，每份細(xì)胞越少，發(fā)育成的個(gè)體的能力越差。體細(xì)胞核移植克隆的動物只有一個(gè)，就是“多利”羊。

三、克隆技術(shù)的福音

1． 克隆技術(shù)與遺傳育種

在農(nóng)業(yè)方面，人們利用“克隆”技術(shù)培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病蟲害的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種，大大提高了糧食產(chǎn)量。在這方面我國已邁入世界最先進(jìn)的前列。

2． 克隆技術(shù)與瀕危生物保護(hù)

克隆技術(shù)對保護(hù)物種特別是珍稀、瀕危物種來講是一個(gè)福音，具有很大的應(yīng)用前景。從生物學(xué)的角度看，這也是克隆技術(shù)最有價(jià)值的地方之一。

3． 克隆技術(shù)與醫(yī)學(xué)

在當(dāng)代，醫(yī)生幾乎能在所有人類器官和組織上施行移植手術(shù)。但就科學(xué)技術(shù)而言，器官移植中的排斥反應(yīng)仍是最為頭痛的事。排斥反應(yīng)的原因是組織不配型導(dǎo)致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供給“原版人”，作器官移植之用，則絕對沒有排斥反應(yīng)之慮，因?yàn)槎呋蛳嗯?，組織也相配。問題是，利用“克隆人”作為器官供體合不合乎人道？是否合法？經(jīng)濟(jì)是否合算？

克隆技術(shù)還可用來大量繁殖有價(jià)值的基因，例如，在醫(yī)學(xué)方面，人們正是通過“克隆”技術(shù)生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素、使侏儒癥患者重新長高的生長激素和能抗多種病毒感染的干撓素，等等。

科學(xué)家發(fā)明了修復(fù)酶了嗎?

　　修復(fù)酶
　　生物細(xì)胞為了保持遺傳物質(zhì)DNA的穩(wěn)定.具有種種機(jī)構(gòu).DNA修復(fù)酶就是其中之一。將受損傷的DNA修復(fù)，修復(fù)成與原來同樣正常的DNA。
　　范德堡大學(xué)生物科學(xué)和生物化學(xué)副教授Brandt Eichman.2015年10月28日在《Nature》雜志上發(fā)表的一項(xiàng)最新研究，發(fā)現(xiàn)了一類新的DNA修復(fù)酶。
　　新發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)酶是一種DNA糖基化酶，DNA糖基化酶是由Tomas Lindahl發(fā)現(xiàn)的一個(gè)酶家族，他獲得了今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，承認(rèn)這些酶可通過一個(gè)稱為堿基切除修復(fù)的過程去除受損的DNA堿基。這是目前生物學(xué)家已經(jīng)確定的10個(gè)不同的基因修復(fù)途徑中的第一個(gè)。

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