噬菌體展示模擬抗原表位診斷血吸蟲病

噬菌體展示模擬抗原表位診斷血吸蟲病

噬菌體能展示各種分子的功能域或抗原、抗體的相應配體結(jié)構。只要有抗體，便可以從噬菌體展示肽庫中篩選出與之相結(jié)合的特異性抗原表位?，F(xiàn)在人們已經(jīng)開始使用多克隆抗體來篩選噬菌體肽庫來尋找某些疾病的診斷抗原。江蘇省血吸蟲病防治研究所科技部對噬菌體展示模擬抗原表位的血吸蟲病診斷價值進行了研究。

方法：將目標噬菌體感染大腸桿菌ER2537進行擴增，用聚乙二醇－8000（PEG－8000）沉淀法純化目標噬菌體。建立以噬菌體為抗原檢測血吸蟲病人血清抗體的血吸蟲病酶聯(lián)免疫診斷方法，以此方法檢測急性、慢性及晚期血吸蟲病人血清，同時檢測健康人及肝吸蟲病人血清，觀察噬菌體抗原診斷血吸蟲病的價值。以同樣的方法平行檢測治療前及治愈后半年及1年的血吸蟲病人血清，觀察噬菌體抗原的療效考核價值。結(jié)果：以混合噬菌體抗原檢測急性、慢性及晚期血吸蟲病人血清，敏感性分別達到94.8％、97.2％和91.9％。檢測健康人血清的假陽性率為5.8％，與肝吸蟲病人血清的交叉反應率為5.1％。檢測29份同一病人治愈后半年的血清，陰轉(zhuǎn)率為37.9％，36份治愈后1年的同一病人血清，陰轉(zhuǎn)率達到58.3％，明顯高于可溶性蟲卵抗原的陰轉(zhuǎn)率。結(jié)論：噬菌體展示模擬血吸蟲抗原表位可以作為血吸蟲病的診斷抗原，有一定的血吸蟲病療效考核價值。

非洲馬瘟的病毒詳解

該病毒無囊膜，直徑約75nm，有兩層20面體對稱的衣殼，由32個殼粒組成?；蚪M由
10個大小不等的雙鏈RNA片段構成，3個大的為L1～L3，3個中等的為M4～M6，4個小的為S7～S10，編碼10個蛋白(VP1～VP7和NS1，NS2，NS3/NS3A)。內(nèi)衣殼由2個主要蛋白VP3和VP7以及3個次要蛋白VP1、VP4和VP6構成，其中VP6被認為是病毒dsRNA的解旋酶[2]。外衣殼由2個蛋白VP2和VP5構成，當病毒通過細胞膜時會被脫掉。此外，至少還有3個非結(jié)構蛋白(NS1，NS2和NS3/3A)存在于受感染的細胞中。 該病毒有9個抗原性不同的血清型[3]。雖然在野外沒有發(fā)現(xiàn)任何型內(nèi)變異的證據(jù)，但通常認為血清型之間有某些交叉的親緣關系，尤其是在AHSV-1和2，AHSV-3和7，AHSV-5和8，以及AHSV-6和9之間。 2.1　VP2蛋白
VP2蛋白由L2基因編碼，是病毒最主要的型特異性抗原，與VP5一起能與病毒的中和抗體發(fā)生反應。AHSV9個血清型L2基因的cDNA有典型的環(huán)狀病毒5′-GTT和TAC-3′的末端序列。L2基因的ORF編碼蛋白的分子質(zhì)量約為123ku。VP2蛋白序列在AHSV9個血清型中的變動范圍為47.6%～71.4%，是AHSV變異率最大的蛋白[4]。
BentleyL等[5]用噬菌體展示技術配合多種抗血清鑒定了重組AHSV-3VP2蛋白的多個抗原區(qū)域。大部分抗原位點和中和位點都在252aa～488aa區(qū)域。這個區(qū)域在病毒各血清型之間不僅差異大，而且大部分是親水性氨基酸，其中369aa～403aa之間有一個線性抗原表位[6]。此外，在有交叉反應的病毒血清型之間，這些抗原位點的內(nèi)部序列有較高的一致性，因此，有交叉反應的血清型病毒之間有更高的同源性。這可解釋血清型之間的血清學交叉反應。
AHSV-4VP2蛋白的主要抗原性區(qū)域位于199aa～414aa，而1aa～199aa(N端)和414aa～1060aa(C端)都無免疫原性[7]。AHSV-4VP2有15個抗原位點，分成兩組。一組覆蓋范圍223aa～400aa，包含12個抗原位點；另一組覆蓋范圍568aa～681aa，包含其他的3個抗原位點。VP5和VP2相互作用，能更好地將VP2的中和表位展現(xiàn)出來，從而增強免疫反應。
15個位點中有3個可誘導產(chǎn)生AHSV-4的中和抗體，其中有2個中和表位分別位于321aa～339aa和3
77aa～400aa[7]。這兩個表位聯(lián)合起來可誘導產(chǎn)生更有效的中和反應，但中和抗體滴度相對較低，不大可能用于生產(chǎn)AHSV的合成疫苗。此效果可能是由于抗體與一個表位結(jié)合后引起構象變化，使得其他抗體與另一表位的結(jié)合更容易；另一原因可能是此兩位點的中和反應在病毒感染中有不同的作用(如病毒與細胞的吸附，病毒的易位等)或它們構成了一個相對不連續(xù)表位的連續(xù)部分。ASHV-9VP2也有兩個中和表位[5]。同時，BTV在相同的區(qū)域也有中和表位，尤其是在328aa～335aa之間和327aa～402aa之間。因此，此區(qū)域可能是環(huán)狀病毒的一個主要抗原表位和重要的中和抗體靶位。這些表位可能在病毒衣殼的表面，因為中和表位通常結(jié)合在病毒表面以阻止病毒與細胞的受體結(jié)合而被細胞攝取。尤其是兩個中和表位在蛋白疏水性最強的區(qū)域，極有可能存在于病毒的表面。用ELISA檢測[7]這15個抗原位點，發(fā)現(xiàn)抗原位點8，11和12能與抗體結(jié)合，而抗原位點4，6和15雖然能與抗體發(fā)生反應，但它們不表現(xiàn)中和活性，尤其是位點4，它雖然在病毒表面，但不誘導產(chǎn)生中和抗體。其他位點不與抗體反應，說明它們可能埋入病毒
非洲馬瘟病毒內(nèi)部排列
表面或雖然暴露于病毒表面，以不被抗體識別的構象形式存在。
2.2　VP5蛋白
VP5蛋白由M6基因編碼。M6基因5′-端非編碼區(qū)的保守序列為5′-GUUAA-3′，此特點也體現(xiàn)在與AHSV相關的BTV和流行性出血熱病毒(epizootichaemorrhagicdiseasevirus，EHDV)中。而3′-端非編碼區(qū)的保守序列為5′-ACAUAC-3′，唯一的例外是AHSV-6，它的3′-端多一個胞嘧啶核苷酸，為5′-ACAUACC-3′。M6基因的ORF編碼蛋白的分子質(zhì)量約56.9ku。
AHSV-6，AHSV-4，BTV-10和EHDV-1的VP5氨基酸序列有較高的一致性[8]。3個保守區(qū)域位于N端(1aa～123aa)，中部(192aa～273aa)和C端(438aa～491aa)。這些保守區(qū)域可能與VP2或VP7相互作用，從而保持病毒結(jié)構的穩(wěn)定性。作為一個外殼蛋白，ASHV各血清型之間的VP5蛋白有很高的相似性，VP5被VP2蛋白包圍，不能與宿主發(fā)生中和反應。
VP5蛋白根據(jù)疏水性分布圖分為兩個部分[8]，N端區(qū)域(1aa～220aa)和C端區(qū)域(約280aa～505aa)，中間是一個丙氨酸-甘氨酸富集區(qū)(200aa～270aa)作為鉸鏈將兩部分連接。N端為螺旋狀，而C端是球形結(jié)構。這些區(qū)域在蛋白相互作用的分子內(nèi)和分子間起穩(wěn)定分子結(jié)構的作用。VP5的重要功能是與更保守的核心蛋白相互作用，以及補償VP2蛋白的變化。VP5能間接影響病毒的血清型，它與VP2相互作用，改變VP2的構象，從而引起病毒血清學特性的變化。
VP5在昆蟲細胞中單獨表達或與VP2共表達都能誘導產(chǎn)生AHSV特異性中和抗體[9]。VP5蛋白免疫顯性最明顯的區(qū)域在N端的330個殘基中，有兩個抗原區(qū)域，151aa～200aa和83aa～120aa，分為8個抗原位點，中和表位在85aa～92aa和179aa～185aa。前一個中和表位在不同的環(huán)狀病毒中高度保守，它的單克隆抗體能識別BTV和EHDV的VP5蛋白。
2.3　VP7蛋白和VP3蛋白
VP7蛋白和VP3蛋白分別由S7和L3基因編碼，是該病毒主要的內(nèi)衣殼蛋白。VP7在ASHV各血清中高度保守，是該
非洲馬瘟抗原結(jié)構
病毒的血清群特異性抗原[10]。MareeS等[11]用重組桿狀病毒在昆蟲細胞中克隆表達了ASHV-9的VP3和VP7，VP7表達水平高且聚集成獨特的晶體，VP3和VP7共表達可在細胞中形成類核心顆粒。AHSVVP7蛋白在感染細胞的胞漿中形成平面六邊形晶體，而由重組桿狀病毒表達的VP7則形成大的盤片狀晶體，在光鏡下可見。
在電鏡下觀察AHSV的VP3和VP7蛋白形成的類核心顆粒與ASHV空核心顆粒非常相似。與ASHV核心不同的是，類核心顆粒有一暗的中央?yún)^(qū)域，呈典型的20面體對稱結(jié)構。外層包圍著一低電子密度層，在形態(tài)上呈結(jié)節(jié)狀突起，并向外延伸，形成有絨毛外觀的類核心顆粒。AHSV類核心顆粒的直徑約為72nm，與BTV的類核心顆粒在冰凍時電鏡下的直徑一致，但比ASHV核心顆粒的直徑稍大。用VP7單克隆抗體與AHSV類核心顆粒反應，對它進行抗體修飾，電鏡下可見每個顆粒都被一層陰影包圍，那是VP7單克隆抗體與VP7外殼相互作用形成的。
Wade-Evans等研究了AHSV-9VP7作為亞單位疫苗的應用效果。以提純的AHSV-9VP7晶體免疫接種小鼠，用AHSV-7攻毒，發(fā)現(xiàn)VP7對小鼠的保護作用非常好。用變性的VP7晶體或細菌原核表達的GST-VP7融合蛋白接種所產(chǎn)生的保護作用比用VP7晶體接種所產(chǎn)生的保護作用要弱，說明VP7蛋白的構象對蛋白的功能有重要作用。而來自用AHSV-9VP7免疫的Balb/c小鼠的被動抗體不能保護新生同系小鼠不受AHSV-7的攻擊，這說明抗體可能不是唯一起保護作用的因素。 該病毒有3個非結(jié)構蛋白，即NS1，NS2和NS3/NS3A。分別由M5，S8和S10基因編碼。
3.1　NS1蛋白
NS1在AHSV中高度保守。Huismans和Els于1979年就發(fā)現(xiàn)在環(huán)狀病毒感染的細胞胞漿中有獨特的病毒特異性微管
非洲馬瘟病毒重組過程
結(jié)構，它由NS1組成。在BTV感染的細胞中存在著大量此類微管，主要在胞核附近或周圍。這些形態(tài)結(jié)構黏附在細胞骨架的中間絲上。它們的作用可能是把成熟病毒粒子從病毒包涵體運到細胞膜，而后由NS3的作用將病毒釋放，或作為分子伴侶防止在次要蛋白(VP1，VP4和VP6)與病毒的基因組正確合并前組裝核心顆粒。
BTV和EHDV的NS1用重組桿狀病毒在昆蟲細胞中表達后都形成了微管。BTV的NS1微管直徑52.3nm，由NS1二聚體形成的螺旋組成，每個螺旋有22個NS1二聚體。Maree和Huismans用桿狀病毒在昆蟲細胞中表達AHSV-6NS1，并用蔗糖梯度密度離心沉降分析NS1微管，在200S～400S處收集到大量目的片段，說明表達的NS1蛋白以微粒或聚合體形式存在于感染細胞中。雖然NS1是這些片段最主要的蛋白成分，但也有數(shù)量不等的某些其他蛋白，推測為桿狀病毒的蛋白。
在200S～400S的NS1復合物中，微管的平均直徑為23nm±2nm，長度最長可達4μm。長度不等可能是由于提純過程中發(fā)生了斷裂，這也可能是NS1在蔗糖梯度中有不同沉降系數(shù)的原因。在電鏡下觀察，AHSV微管的精細結(jié)構與BTV和EHDV微管在外觀上很不相同。AHSV微管有一內(nèi)部結(jié)構，呈細微的網(wǎng)狀交叉波紋狀。每個微管的中央?yún)^(qū)域有交替伸展的電子密度，而低密度區(qū)表示微管的空腔。微管的邊緣平滑，界線分明，無可見的亞單位結(jié)構。在更寬的BTV微管(68nm)和EHDV微管(52nn)中無梯狀或分節(jié)段的外觀。中空環(huán)狀結(jié)構可能表示微管的橫切面或大微管的非常短的小節(jié)段。這些結(jié)構的直徑與ASHV微管相符，其空腔直徑約為7nm。
在200S～400S片段中還有少量桿狀病毒的特異性微管。這些微管與AHSV微管明顯不同，它們更大(直徑40nm)，且精細結(jié)構也不同?？捎每贵w鑒定AHSV微管。將微管固定在網(wǎng)格上，用ASHV-6抗血清與之結(jié)合。由于抗體與NS1結(jié)合，電鏡下觀察可見在NS1微管周圍有暗影，而桿狀病毒微管則無。
NS1微管在0.2mol/L和更高濃度的CaCl2中不穩(wěn)定，只能見到無定形的蛋白聚集物。在1mol/L的NaCl中，只能見到少量微管，它們的長度明顯減小，環(huán)狀形態(tài)非常多。在緩沖液中或pH8.0～8.5之間，微管形態(tài)也受到嚴重影響，長度減小，精細結(jié)構消失。NS1微管能耐受相對低的pH，但在堿性條件下，它們比BTV微管更易降解。在pH5.0～5.5之間，微管的長度減小，而表面則變得不平滑。在pH5.0或更低時，微管變性，NS1聚集成無定形的蛋白聚集物。
3.2　NS3/NS3A蛋白
與NS1和NS2的高表達水平相比，兩個最小的非結(jié)構蛋白NS3和NS3A在感染細胞中合成量很少。這兩個相關的蛋 白由S10基因上兩個同相重疊的開放閱讀框編碼，兩者唯一的不同是NS3的N末端比NS3A多10個氨基酸。NS3存在于感染細胞的胞膜中，特別是在Vero細胞胞膜上的AHSV釋放位點，說明NS3與病毒的形態(tài)發(fā)生和釋放有關。病毒釋放可先于細胞病變效應或細胞溶解而發(fā)生。由重組桿狀病毒表達的AHSVNS3是膜相關蛋白，它的定位不依賴于AHSV顆粒的存在。此外，ASHVNS3用重組桿狀病毒表達時只合成24ku的NS3蛋白，不合成NS3A。
AHSVNS3的變異率在AHSV各蛋白中僅次于外衣殼蛋白VP2[12]。ASHV-8的NS3型間變異率達27.6%，而ASHV-4的NS3型間變異率只有15%。型間變異率大可用來區(qū)分同型病毒的亞群。NS3序列的差異可用于區(qū)分同種血清型的野毒株和弱毒活疫苗株，2.3%～9.7%的變異率就足以進行區(qū)分，尤其是與系統(tǒng)進化分析聯(lián)合應用時。
ASHVNS3的種系發(fā)生研究將NS3蛋白分成3個不同的種系發(fā)生譜系，命名為α，β和γ[13]。AHSV-4，5，6，8和9的NS3屬α，ASHV-3，7和8的NS3屬β，ASHV-2的NS3屬γ。雖然3個NS3進化群區(qū)別明顯，但是某一特定AHSVNS3屬于哪個進化群并不是只由病毒血清型決定。AHSV的基因重排可以解釋一些較大的變異率?；蛑嘏旁诜止?jié)段基因組的病毒中是自然發(fā)生的，如正黏病毒(Orthomyxovirus)和呼腸病毒。多個ASHV血清型混合感染斑馬和馬都可能使得S10片段在不同血清型之間發(fā)生重組。NS3表型群的血清型分組提示那些在同一NS3進化群中的血清型病毒更易發(fā)生S10基因的交換。
AHSV-3至9的NS3長為217aa，而ASHV-2的NS3蛋白則有218aa。NS3的保守區(qū)域包括NS3A的甲硫氨酸起始密碼子，一個脯氨酸富集區(qū)(22aa～34aa)，43aa～92aa的高度保守區(qū)，以及可形成跨膜螺旋的兩個疏水結(jié)構域(116aa～137aa和154aa～170aa)[14]。這些結(jié)構特征在其他環(huán)狀病毒包括BTV的NS3蛋白中很普遍。BTVNS3的兩個疏水區(qū)域跨越胞膜[15]。BTVNS3還有糖基化位點，此糖基化作用可以阻止BTVNS3降解[15]。除了一些保守特性，AHSVNS3與BTVNS3有很大的不同。沒有證據(jù)表明AHSVNS3的糖基化有重要作用，因為某些病毒血清型的NS3沒有推測的糖基化序列。BTVNS3在桿狀病毒表達系統(tǒng)中高水平表達，而AHSVNS3的表達水平低，只能以免疫印跡或放射性標記法來檢測。
AHSVNS3中大部分有差異的氨基酸存在于3個區(qū)域，即N端的43個氨基酸，93aa～153aa之間和C端的15個氨基酸。變異最大的區(qū)域(變異率為82.4%)位于136aa～153aa之間。ASHV除了AHSV-2，所有血清型的NS3蛋白在第123aa處有一保守的半胱氨酸，ASHV-2NS3蛋白的半胱氨酸在第120aa處，而第2個半胱氨酸(164aa)在所有血清型中都保守。此外，還有一個高度保守的N-十四烷基化基序(60aa～65aa或59aa～64aa)，位于蛋白在細胞膜上的錨定區(qū)域。在十四烷基化基序的末端是一個帶陽性電荷的氨基酸區(qū)域。這兩個特點都在上述所說的43aa～92aa的高度保守區(qū)域內(nèi)。與其它環(huán)狀病毒的NS3蛋白比較，所有這些蛋白的氨基末端區(qū)域的N-十四烷基化基序高度保守。僅僅十四烷基化還不能給蛋白提供足夠的能量使之附著在磷脂雙層膜上。其他病毒的膜相關/結(jié)合蛋白，如Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1)的Gag蛋白和勞氏肉瘤病毒的Src蛋白，含有一個堿性氨基酸區(qū)域，它能穩(wěn)定膜的相互作用。所有環(huán)狀病毒NS3蛋白中有一個類似的二聯(lián)基序，它可能是NS3蛋白的膜靶向信號。
ASHVNS3的兩個疏水區(qū)與細胞毒性效應有關。任意一個疏水區(qū)的變異不會改變蛋白對膜的靶向性，但能解除它們在膜上的錨定，從而阻止它們在細胞表面的定位并消除它們的細胞毒性效應。桿狀病毒表達的AHSVNS3對昆蟲細胞(Spodopterafrugiperda，Sf9細胞)的細胞毒性效應是通過改變細胞膜的通透性而實現(xiàn)的。

簡述血吸蟲的病原學檢查和免疫學診斷方法。

病原學檢查首先采用糞檢，可用直接涂片法、集卵法和毛蚴孵化法；必要時可用纖維直腸鏡檢、直腸粘膜活檢。免疫學檢查可用皮內(nèi)試驗和檢測抗體(如環(huán)卵沉淀法、間接血凝試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等)。

(1)血吸蟲病實驗診斷的主要方法?(2)日本血吸蟲卵的主要形態(tài)特征?

①糞便檢查：直接涂片檢查蟲卵，毛蚴孵化法等；②直腸鏡活組織檢查：可通過對活組織的染色檢查蟲卵及鑒定蟲卵的死活。
其形態(tài)學主要特征為：淡黃色，橢圓形，無小蓋，卵殼均勻，表面常粘附有許多宿主組織殘留物，側(cè)棘短小，卵內(nèi)含有一成熟毛蚴。

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