生殖器皰疹在發(fā)病的時(shí)候,會(huì)有一些明顯的特點(diǎn),而且它還可能會(huì)出現(xiàn)其他的病發(fā),正比如爆震性宮頸炎,或者是皰疹性直腸炎,會(huì)讓患者出現(xiàn)全身疼痛,或者是周身不適的癥狀。
1、診斷的難度大
由于生殖器皰疹的不典型發(fā)作與女性病變所涉及的部位極其廣泛復(fù)雜,因而使得本病的診斷的難度大大加大。
2、可能并發(fā):
皰疹性宮頸炎、皰疹性直腸炎、新生兒皰疹感染與畸形死胎,女性較男性更容易出現(xiàn)并發(fā)癥,如蔓延形成:無(wú)菌性腦炎、骶神經(jīng)根??;多見(jiàn)合并盆腔炎、子宮附件炎、陰道反復(fù)難治愈的白色念珠菌與陰道加特納氏菌感染等等,遠(yuǎn)期如宮頸癌、糖尿病、其他腫瘤(合并消化道疾病而出現(xiàn)胃癌、結(jié)腸癌等等)。
3、皰疹性宮頸炎:
可以無(wú)癥狀;70%--90%患者表現(xiàn)為彌漫性或者局限性的宮頸充血與脆性增加,宮頸糜爛或者壞死性的宮頸炎,檢查時(shí)可以引起嚴(yán)重的盆腔疼痛,宮頸觸痛,易出血。
4、生殖器皰疹感染的一般癥狀:
可以沒(méi)有癥狀,也可以表現(xiàn)為頭疼、全身疼痛、發(fā)熱或伴有全身不適癥狀;
5、累及尿道出現(xiàn)排尿障礙及燒灼樣排尿疼痛,有的患者說(shuō)經(jīng)常尿道火辣辣的,就是這個(gè)意思!發(fā)展嚴(yán)重乃至出現(xiàn)尿潴留。
針灸培訓(xùn)一、癥狀
HSV感染是一種全身性疾病,病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進(jìn)入人體,可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺(jué)神經(jīng)節(jié)和多數(shù)器官內(nèi),幾乎所有的內(nèi)臟和粘膜表皮內(nèi)都可分離到HSV。
原發(fā)感染多為隱性,大多無(wú)臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn),僅有少數(shù)(約1-10%)可以出現(xiàn)臨床癥狀。主要見(jiàn)于免疫功能低下嬰幼兒或嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良或有其它感染的兒童,成人罕見(jiàn)。原發(fā)感染消退后,病毒可持續(xù)潛居體內(nèi)。正常人中約有半數(shù)以上為本病毒的攜帶者,可通過(guò)口、鼻分泌物而成為傳染源,由于HSV在人體中不產(chǎn)生永久免疫力,故每當(dāng)機(jī)體抗病能力減退時(shí),如患某種發(fā)熱性傳染病,胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染、過(guò)度疲勞、情緒環(huán)境改變時(shí),體內(nèi)潛伏的HSV即被激發(fā)而發(fā)病。
HSV-1主要引起口唇皰疹,咽炎,角膜結(jié)膜炎和散發(fā)性腦炎,而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹,但在臨床上也有相反情況。
HSV感染的潛伏期為1-45天,平均為6天,HSV-1感染主要發(fā)生于口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處,亦可見(jiàn)顏面或口唇,開(kāi)始局部先有灼癢及輕度緊張感,偶有伴發(fā)神經(jīng)痛。隨即出現(xiàn)紅斑,在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生簇集性小丘疹,迅速變?yōu)樗诹V辆G豆大小的水皰,內(nèi)容澄清,水皰破裂后出現(xiàn)糜爛面,數(shù)日后干燥結(jié)痂。自覺(jué)灼癢,偶有倦怠,不適和輕微發(fā)熱等全身癥狀,愈合可遺留暫時(shí)性色素沉著。全病程1-2周左右。
HSV-2感染主要發(fā)生于生殖器部位,患部先有燒灼感,很快在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生成群的小水皰,多見(jiàn)男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處,偶見(jiàn)于尿道;女性常見(jiàn)于陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰,約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍,自覺(jué)疼痛。病人可發(fā)生尿道炎,出現(xiàn)排尿困難。多數(shù)人有腹股溝淋巴結(jié)腫大疼痛,有的病人可出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉痛及腦膜炎癥狀。如發(fā)于女性宮頸者可形成潰瘍壞死,陰道分泌物增多,可有下腹痛。應(yīng)注意有無(wú)宮頸癌發(fā)生。孕期患生殖器皰疹時(shí)易致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎,并易使新生兒感染,發(fā)生新生兒?jiǎn)渭儼捳?。本病一般?jīng)過(guò)3周左右可以痊愈,但常有反復(fù)發(fā)作,一般原發(fā)疹后1-4個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā),癥狀較原發(fā)者輕,范圍亦小,局限于生殖器部位,有時(shí)僅有1-2個(gè)皰疹,病程亦短,自發(fā)病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染,如口唇、臂部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。
二、體征
皮損為紅斑基礎(chǔ)上可見(jiàn)成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎,宮頸可見(jiàn)發(fā)紅、糜爛、潰瘍,有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結(jié)腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現(xiàn)在口唇、手指、臀部、大腿、手臂,甚至眼部與咽喉。并發(fā)腦膜炎或橫貫性脊髓炎,一般于發(fā)疹后3-12天出現(xiàn)頸項(xiàng)強(qiáng)直等顱內(nèi)壓增高的現(xiàn)象。
三、潛伏感染和復(fù)發(fā)
HSV感染人體后1周左右,血中出現(xiàn)中和抗體,3-4周達(dá)高峰,可持續(xù)多年,這些抗體能清除病毒和使機(jī)體康復(fù),但大多數(shù)個(gè)體不能徹底消滅病毒,也不能阻止復(fù)發(fā),病毒以潛伏狀態(tài)長(zhǎng)期存在宿主體內(nèi)。不同亞型HSV感染者急性首發(fā)生殖器皰疹的臨床過(guò)程相似,但生殖器病變復(fù)發(fā)率不同,首發(fā)HSV-2感染者約90%,在12個(gè)月內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一次復(fù)發(fā)(平均復(fù)發(fā)4次),而初次感染HSV-1者僅50%出現(xiàn)類似復(fù)發(fā)(平均復(fù)發(fā)次數(shù)小于1)。不同個(gè)體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的復(fù)發(fā)率變化很大,大多數(shù)年復(fù)發(fā)5-9次,一般在原發(fā)皰疹消退后1-4個(gè)月內(nèi)發(fā)生,有些患者受到促發(fā)因素,如發(fā)熱、月經(jīng)、日曬、寒冷、某些病毒感染等的影響而復(fù)發(fā),其特點(diǎn)是每次復(fù)發(fā)往往發(fā)生在同一部位,復(fù)發(fā)前可有前驅(qū)癥狀如局部瘙癢,發(fā)疹前數(shù)小時(shí)感染部位有灼燒,麻刺感。
復(fù)發(fā)生殖器皰疹(GH)對(duì)患者心理影響較大,由于目前尚無(wú)預(yù)防復(fù)發(fā)的有效療法及可能有誘發(fā)生殖器惡變的危險(xiǎn)性,故給患者帶來(lái)心理影響,患者多有抑郁、恐懼等心理障礙,這又直接影響HSV的復(fù)發(fā)。我們的治療經(jīng)驗(yàn),只要患者堅(jiān)持規(guī)律治療,都能治愈。
四、HSV與HIV感染:
HSV常與HIV-1同時(shí)感染,并能促進(jìn)病情發(fā)展,引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素,能激活HIV復(fù)制,Heng對(duì)6例AIDS合并生殖系統(tǒng)HSV皮膚損害患者進(jìn)行皮膚活檢,發(fā)現(xiàn)角化細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有HIV-1和HSV-1雜交后使HIV-1保留其感染性,而無(wú)需與CD4分子結(jié)合即能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1,而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的復(fù)制。
表皮細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性,其中可見(jiàn)有嗜酸性包涵體。表皮開(kāi)始為網(wǎng)狀變性形成的多房性水皰,以后聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫,有輕重不等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。反應(yīng)嚴(yán)重時(shí)可有嚴(yán)重血管炎表現(xiàn)。
HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史,而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰,易復(fù)發(fā)等不難診斷。必要時(shí)可作皰液涂片,培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測(cè)定等,均有助于診斷和確定病毒類型。
一、細(xì)胞學(xué)方法
對(duì)皮損刮片做Wright-Gemsa(Tzanck試驗(yàn))或Papanicolaou染色,可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體,但不能區(qū)別HSV感染或水痘―帶狀皰疹病毒感染,敏感性僅為病毒分離的60%。
二、培養(yǎng)法
從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒,為目前較敏感、最特異的檢查方法,需5-10天,因其技術(shù)條件要求高,價(jià)格昂貴,不能普遍使用。
三、抗體檢測(cè)
目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測(cè),如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測(cè)HSV-2抗體,具有敏感性,且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點(diǎn)。
四、基因診斷
(一)用PCR分型檢測(cè)單純皰疹病毒
PCR是一種敏感性高,特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)方法,標(biāo)本中含有1fgHSV-DNA就可以檢出,其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快,且分型檢測(cè)HSV是發(fā)展的趨勢(shì)。
1、標(biāo)本采集和處理
(1)標(biāo)本采集
①腦脊液:直接無(wú)菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無(wú)菌試管送檢.如肉眼可見(jiàn)血色,應(yīng)離心取上清。
②羊水及嬰兒血清:同上,應(yīng)避免溶血.
③腦組織:腦組織尸檢、活檢標(biāo)本,加1mlPBS標(biāo)本緩沖液研磨后,待檢。
④眼及皮膚病灶分泌物:用預(yù)測(cè)(半干)棉拭子直接取患處分泌物,置1mlPBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
⑤生殖器(宮頸、陰道、外陰、陰莖)標(biāo)本:先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢,再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物,置1mlPBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
(2)標(biāo)本處理
①預(yù)處理:所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備;可以取100μl標(biāo)本液,離心5000r/min×5min后,去上清,取沉淀物進(jìn)行模板制備。
②模板制備:a:蛋白酶K消化裂解法:沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1h后,煮沸10min,離心5000r/min×5min,收集上清。b:水煮法:沉淀物加100μl蒸餾水,搖均水煮20min,離心5000r/min×5min收集上清。c:1%TritonX-100裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl,加入1μlTritonX-100,水煮20min,5000r/min×5min,收集上清。d:5%NP-40裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl,加5μlNP-40,水煮20min,5000r/min×5min收集上清。e:如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后,再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA,加10μlDW溶解待檢。
2、PCR擴(kuò)增
(1)引物設(shè)計(jì)。以HSVDNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測(cè)靶序列以確保特異性。設(shè)計(jì)3個(gè)引物,一個(gè)上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):二個(gè)下游特異性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′)和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分別擴(kuò)增出HSV-1469bpDNA片段(1981~2359)、HSV-2391bp片段(1561~1953):從二型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計(jì)了一個(gè)不分型的特異性探針HSVP35‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3‘)。
(2)PCR實(shí)驗(yàn)體系。取模板10μl:DNAP50.5(0.2μmol/L):DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L):DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L):4×dNTP8μl(4×200μmol/L):10×dNTP8μl(4×200μmol/L);10×緩沖液10μl:DMSO4μl;加DW65.5μl;石蠟油30μl.。
水煮(96℃~100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)
72℃4min
↓
95℃40s
↓
65℃60s→72℃70s
↓33個(gè)循環(huán)
70℃4min
3.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法:取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后,點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳15~20min,溴化乙錠(EB)染色5min,于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽(yáng)性結(jié)果,HSV-2帶在前,HSV-1帶在后,無(wú)帶則為陰性結(jié)果。
(2))XhoI酶譜法:取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加X(jué)hoI50U,37℃1h后,置3%瓊脂糖凝膠中,70V電泳15~20min,可產(chǎn)生46bp片段帶(引物后面);與正常PCR產(chǎn)物比較,XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。
(3)Southern印跡法:PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后,用變性液處理60min,再用中和液處理90min,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上:80℃烤膜2h,42℃預(yù)雜交(雜交液中)30min,加入32p標(biāo)記HSVP3探針后,42℃雜交過(guò)夜;次日用1%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12~15h,顯影為陽(yáng)性,不顯影為陰性。
(二)套式PCR
套式PCR(nestedprimers-polymerasechainreaction,NP-PCR)是通過(guò)“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對(duì)引物,即一對(duì)擴(kuò)增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對(duì)位于擴(kuò)增產(chǎn)物中再擴(kuò)增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物,這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測(cè)的靈敏度,保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型,能100%檢出HSV-1,50%檢出HSV-2,應(yīng)改進(jìn)分型檢測(cè)HSV,更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。
1、標(biāo)本處理:
(1)標(biāo)本采集同上
(2)DNA制備:①腦脊液:取100μlCSF水煮15min,加入250μl無(wú)水乙醇,放-30℃10min;離心10000g30min,去上清,30℃干燥后,加入10μlDW;②腦組織細(xì)胞:取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10min;取上清加入等體積酚一氯仿(V/V),輕搖10min,離心10000r/min×10min;取水相,加入250μlDW溶解。
2、PCR擴(kuò)增
(1)引物設(shè)計(jì):選擇HSV1糖蛋白D基因?yàn)闄z測(cè)靶基因。
NP-PCR的引物和探針序列
“外”引物
BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43
BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239
“內(nèi)引物”
BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79
BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188
探針
BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125
(2)PCR實(shí)驗(yàn)體系和程序:反應(yīng)體積為50μl;模板10μl;BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L);BJHSV1.20.5μl(0.2pmol/L);10×緩沖液5μl;4×dNTP4μl(4×200mmol/L);DW27μl;石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)20次,取其擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進(jìn)行套式擴(kuò)增,先95℃變性2min,循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)30次后,72℃延伸5min;。
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析:
①瓊脂糖凝膠電泳染色法:
取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min,于紫外燈下觀察結(jié)果,在溴酚蘭后面有一條,或二條亮紅條帶為陽(yáng)性結(jié)果,HSV-2帶在前,HSV-1帶在后,無(wú)帶則為陰性結(jié)果。
②Southern印跡法:
PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后,用變性液處理60min,再用中和液處理90min,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,80℃烤膜2h,42℃預(yù)雜交(雜交液中)30min,加入32P標(biāo)記HSV探針后,42℃雜交過(guò)夜,次日用1%SDS/PBSpH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi),放射性自顯影12-15h,,顯影為陽(yáng)性,不顯影為陰性。
(三)、聚合酶鏈反應(yīng)―酶譜法(polymerasechainreaction-endonucleasecleavagePCR-EC)
具有經(jīng)濟(jì)廣泛等特點(diǎn);不僅能一次性分型檢測(cè)HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四種病毒,而且方法本身快速、方便、無(wú)放射線損傷,易被實(shí)驗(yàn)室接受。可檢出3個(gè)CFU的HSV1,靈敏度高,能檢測(cè)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSVDNA陽(yáng)性結(jié)果,并可用于藥物治療效果的評(píng)價(jià)。由于病毒的變異性,會(huì)出現(xiàn)酶切點(diǎn)突變丟失現(xiàn)象,從而造成酶切陰性結(jié)果。對(duì)此可以通過(guò)型特異性探針或序列分析解決。
1.標(biāo)本處理
(1)標(biāo)本采集,方法同上。
(2)DNA模板制備:每份標(biāo)本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用1h;
加入等體積的酚―氯仿(v/v)輕搖10min,離心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍體積)無(wú)水乙醇,-20℃過(guò)夜沉淀DNA,離心15000r/min×5min,吸去液體,30℃干燥后,加蒸餾水25μl溶解,待檢。
2.引物設(shè)計(jì):
P1,5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2,5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
(1)PCR實(shí)驗(yàn)體系:
反應(yīng)體積100μl;模板10μl;P10.5μl(10pmol/L),P20.5μl(10pmol/L);4×dNTP4μl(4×200mmol/L);10×緩沖液10μl,DMSD5μl,DW65μl,循環(huán)參數(shù)為94℃60s;60℃60s;72℃60s;循環(huán)40次72℃延伸4min。
(2)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與酶切分型.
①第一步電泳鑒定:取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小。
②酶切分析:分別取20μlPCR產(chǎn)物于2個(gè)Eppendorf管中,加入50μl無(wú)水乙醇,-20℃沉淀DNA,再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解,加入SmaI或BamHI50U于相應(yīng)Eppendorf管內(nèi),37℃作用1h。
③第二步電泳分型,取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液,加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min后,EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對(duì)照。紫外燈下觀察,結(jié)果如下:
PCR-EC法檢測(cè)四種病毒結(jié)果
病毒型號(hào)靶片段SmaIBamHI
HSV1518bp476bp+42bp
HSV2518bp―225+293bp
EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp
CMV589bp不需酶切,第一步電泳就可以區(qū)分
(四)用RT-PCR檢測(cè)單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(RNA-PCR),可能通過(guò)檢測(cè)HSV不同期的RNA,這不僅可診斷HSV感染,而且有利于HSV的潛伏期感染機(jī)制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)產(chǎn)生cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以達(dá)到檢測(cè)目的。因此,RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標(biāo)本處理:
組織塊細(xì)胞總RNA提取,取100mg組織標(biāo)本,加1ml硫氰酸胍變性液,于勻漿器中,室溫研磨均勻后,移入2.5mlEppendorf管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s,置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。離心15000r/min×10min,棄上清,RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉淀,-20℃1h,沉淀RNA.離心15000r/min×10min,去上清,沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次,真空干燥。.加10μlTE緩沖液(pH7.4)溶解,低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。
2、PCR擴(kuò)增:
(1)引物設(shè)計(jì):選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測(cè)靶基因.設(shè)計(jì)2個(gè)引物,
P15′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT3′
P25′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG3′可以擴(kuò)增ICPO中266bp序列。
1個(gè)探針:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
(2)PCR實(shí)驗(yàn)體系:總反應(yīng)體積為50μl,模板10μl(0.25-1.0μg)P11μl(20pmol/L);P21μl(20pmol/L);4×dNTP4μl(200μmol/L);10×緩沖液5μl;AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl(50U);DW26μl;循環(huán)參數(shù),94℃變性2min后94℃50s,60℃60,72℃60s,循環(huán)40次后72℃延伸5min。
3、擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定:
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法:取10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳15-20min,EB染色5min。紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶。
(2)Southern印跡雜交法:用32P標(biāo)記的特異性探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物,方法同上。
總之,在HSV感染性疾病的臨床診斷中,PCR能對(duì)前病毒或潛伏期低復(fù)制的HSV特異性靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),遠(yuǎn)較DNA探針敏感,并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此,PCR無(wú)論是作為基礎(chǔ)研究手段,還是作為臨床檢驗(yàn)診斷方法,均具有廣闊的前景。
五、病理組織學(xué)診斷
細(xì)胞內(nèi)水腫,基底層形成大水皰,病灶周圍有多核巨細(xì)胞浸潤(rùn),特別是多核白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞充斥于病灶中間。
1.原發(fā)性GH
(1)潛伏期:為2~7天,常為3~5天。
(2)好發(fā)部位:男性多發(fā)生于龜頭、冠狀溝、尿道口、陰莖體及陰囊。女性好發(fā)于外陰、陰道及宮頸。兩性均可見(jiàn)于肛周、大腿及臀部。
(3)皮損形態(tài)及演變:患處先有燒灼感,隨即出現(xiàn)多個(gè)群集的紅色斑丘疹,并迅速變成小水皰。皰液起初清亮,以后漸變?yōu)槟撔浴K捯灼茲?,形成糜爛或淺潰瘍,伴明顯疼痛。之后結(jié)痂而愈,病程約2~4周。
(4)全身癥狀:發(fā)病前或發(fā)病時(shí)可有全身癥狀,如發(fā)熱、頭痛、全身不適、頸項(xiàng)強(qiáng)直和骶2~4段感覺(jué)異常,或有排尿困難和白帶增多。幾乎所有患者均可伴腹股溝淋巴結(jié)腫大及壓痛。
2.復(fù)發(fā)性GH
約在原發(fā)性GH痊愈后1~4個(gè)月發(fā)生。首次HSV-2感染后1年內(nèi)近60%的患者復(fù)發(fā),第1年內(nèi)可復(fù)發(fā)4~6次,以后復(fù)發(fā)次數(shù)減少。eves等發(fā)現(xiàn)在生殖器感染者中,HSV-1感染者復(fù)發(fā)率為14%,而HSV-2感染者則有60%復(fù)發(fā)。
復(fù)發(fā)性GH患者可有上述激發(fā)因素,或有前驅(qū)癥狀,全身癥狀較輕,復(fù)發(fā)部位多在原處,病程也較短,皮損約經(jīng)10天左右即消退。由于病損反復(fù)發(fā)作,難以控制,患者易出現(xiàn)精神負(fù)擔(dān)和性功能障礙,甚至發(fā)生抑郁癥等。但其損害與原發(fā)性者甚為相似。
3.特殊型GH
(1)男性同性戀者GH:本病僅次于淋球菌引起的肛門直腸炎。有人從62例有肛門直腸癥狀但淋球菌檢查陰性的男性同性戀者中,29%檢出了HSV-2。臨床表現(xiàn)多為嚴(yán)重的肛門、直腸疼痛,其他癥狀為便秘、肛門內(nèi)有分泌物、里急后重和發(fā)熱等。部分病人肛周有水皰或潰瘍。
(2)孕婦和新生兒GH:孕婦患GH后,其后果嚴(yán)重。對(duì)妊娠GH患者HSV-2攜帶者來(lái)說(shuō),最重要的是傳染給新生兒。當(dāng)產(chǎn)道內(nèi)存在HSV-2時(shí),可有40%~60%的新生兒遭受感染,感染嚴(yán)重者可致死亡。
在妊娠早期,患GH的孕婦可影響胎兒,導(dǎo)致流產(chǎn)或死胎。新生兒的先天性感染,出生時(shí)可出現(xiàn)帶狀分布的皰疹、癲癇發(fā)作、出血傾向與肝脾腫大。如通過(guò)產(chǎn)道感染或胎膜早破而發(fā)生逆行感染時(shí),輕者出生后數(shù)日至數(shù)周可無(wú)臨床癥狀,早期可僅有吃奶較差、興奮,以后可發(fā)生病毒血癥或皰疹性腦炎,重者發(fā)生播散性HSV感染,可出現(xiàn)高熱、呼吸困難、出血及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,預(yù)后不良。
因此,妊娠足月患GH者,如時(shí)間允許,應(yīng)每周從陰道及子宮頸取材,檢查有無(wú)病毒感染,若細(xì)胞學(xué)或病毒培養(yǎng)陽(yáng)性而羊膜尚完整,或破裂后不足6h,建議剖宮產(chǎn),以避免胎兒經(jīng)陰道分娩而發(fā)生新生兒HSV感染。
HSV-2感染與宮頸癌:有證據(jù)表明,生殖器HSV-2感染可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。血清流行病學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),宮頸癌患者血清中抗HSV-2抗體較對(duì)照組婦女明顯增高。Nahmias等發(fā)現(xiàn),GH患者發(fā)生宮頸非典型增生者為對(duì)照組的2倍,而發(fā)生原位癌者則為對(duì)照組的8倍。近年來(lái)研究證明,患侵襲性宮頸癌和癌前期病變的婦女宮頸脫落細(xì)胞中,HSV-2抗原陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組,這種HSV-2抗原位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),提示為腫瘤細(xì)胞表達(dá)的病毒抗原。有人發(fā)現(xiàn),宮頸有高度非典型增生、原位癌及鱗狀細(xì)胞癌者的活檢組織中,用間接免疫熒光染色可發(fā)現(xiàn)其中的HSV-2抗原。應(yīng)用DNA-RNA原位雜交技術(shù)在宮頸癌和癌前期組織中67%可發(fā)現(xiàn)HSV-2特異性mRNA。Frenkel等在宮頸癌組織中檢出HSV-2的DNA。還有作者從手術(shù)切除后經(jīng)放射的宮頸癌病變組織中分離出了HSV-2。
HSV-2感染與HIV感染與其他生殖器潰瘍性疾病一樣,GH增加了HIV感染的危險(xiǎn)性。HSV感染是HIV感染的輔助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性戀者中,HSV-2感染率更高,且GH的并發(fā)癥多而嚴(yán)重。在AIDS患者中,耐阿昔洛韋(無(wú)環(huán)鳥苷)的HSV毒株感染多見(jiàn)。
根據(jù)病史、癥狀和皮膚或黏膜表現(xiàn),一般不難作出診斷。必要時(shí)可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查,以明確病原體。
中醫(yī)病機(jī)和辨證本病多因體內(nèi)蘊(yùn)熱,外感毒邪,熱毒相結(jié),肝膽二經(jīng)濕熱下注而生;或因肌膚虛弱,邪毒留膚,遇熱即發(fā)。
中醫(yī)辨證分型
1.濕熱下注型
主證:患處水皰、糜爛、癢痛交作,大便秘結(jié),小便短赤。舌紅,苔黃膩,脈弦滑數(shù)。
辨證:濕熱下注,外感毒邪。
2.肝腎虧損型
主證:病情反復(fù)發(fā)作,兼有心煩寐少,腰酸頭昏,食少乏味,口干咽燥。舌質(zhì)淡,脈沉細(xì)。
辨證:清熱化濕,養(yǎng)肝滋腎。
1.原發(fā)性生殖器皰疹:從感染到發(fā)病一般為3-5天,患處先有燒灼感,然后出現(xiàn)紅斑,繼之在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生多群紅色丘疹,并感到熱癢,不久即可變成小水庖,數(shù)日后水皰變?yōu)槟撔?,破后可形成糜爛,最后可結(jié)痂痊愈。整個(gè)病程15-20天。
2.復(fù)發(fā)性生殖器皰疹。大約有60%的原發(fā)患者,會(huì)在一年內(nèi)再次復(fù)發(fā),第1年至少?gòu)?fù)發(fā)數(shù)次,第2年則逐漸減少。復(fù)發(fā)后一般癥狀比較輕,也沒(méi)有淋巴結(jié)腫大,病程也短。
引起復(fù)發(fā)的誘因,多為感冒發(fā)燒、上火、月經(jīng)來(lái)潮、性交過(guò)頻、疲勞過(guò)度、消化不良和氣候干燥等。
復(fù)發(fā)時(shí),患處可感到有熱刺和癢感。
看你那癥狀,有很大的可能是,這個(gè)是傳染的。所以,趕緊去當(dāng)?shù)卣?guī)的大醫(yī)院,檢查去。要真是,就趕緊治。真的傳染的。
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