張鋒公司新文章：如何提高CRISPR基因組編輯的特異性

2016年08月22日訊 CRISPR是規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的縮寫。CRISPR與內(nèi)切酶Cas9是一對好基友，細菌依靠它們組成的防御系統(tǒng)對抗外來侵略者。CRISPR-Cas9能夠在引導(dǎo)RNA的指引下，靶標并切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統(tǒng)發(fā)展成了強大的基因組編輯工具。該系統(tǒng)使用簡單而且擴展性強，很快便成為了生物學領(lǐng)域最耀眼的明星。

在過去的四年中，CRISPR-Cas9經(jīng)歷了不斷的更新?lián)Q代。這一技術(shù)讓基因功能研究達到了前所未有的精確性和靈敏度。CRISPR-Cas9在醫(yī)療領(lǐng)域也展現(xiàn)了極大的潛力，有望通過直接校正致病突變治療遺傳疾病。不過，我們都知道Cas9會在脫靶位點結(jié)合和切割DNA。

CRISPR脫靶效應(yīng)常被人們掛在嘴邊，這也是該技術(shù)最大的隱患之一。Cas9酶有時會在靶點以外的地方進行切割，而這種切割有可能引起癌癥。好在，研究者們在提升CRISPR特異性的時候動作很快。

Editas Medicine公司的研究團隊在本期Molecular Cell雜志上發(fā)表文章，回顧了Cas9特異性研究近年來取得的突破。這篇文章著重介紹了提高Cas9特異性的關(guān)鍵工具和策略，為從事基因組編輯的研究者們提供了一份綜合性的實用手冊。文章指出，研究者們現(xiàn)在應(yīng)當努力使這樣的方法標準化，同時進一步改善CRISPR-Cas9的特異性。Editas Medicine公司是CRISPR技術(shù)先驅(qū)張鋒等人創(chuàng)立的，致力于通過基因編輯治療人類疾病。

張鋒是麻省理工學院腦與認知科學助理教授、McGovern 腦研究所和Broad研究所核心成員，著名CRISPR技術(shù)先驅(qū)。曾榮獲美國生物醫(yī)學大獎：瓦利基金青年研究家獎。去年年底，張鋒的研究團隊對化膿鏈球菌的Cas9進行了3個氨基酸的改造，建立了革命性的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，大大減少了“脫靶”編輯錯誤。這一完善的技術(shù)解決了使用基因組編輯時面對的一個主要技術(shù)問題。

今年一月，韓國首爾大學的研究人員在Genome Research雜志上發(fā)表文章，為人們展示了升級版的多重化Digenome-seq。他們用這一技術(shù)同時分析了11個CRISPR-Cas9核酸酶在整個基因組中的特異性，大大節(jié)省了CRISPR脫靶分析所需的時間和經(jīng)費。研究證實，多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脫靶位點。研究人員還在此基礎(chǔ)上給出了減少CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的指南。

加州大學伯克利分校的研究人員對CRISPR-Cas9技術(shù)做出了重大改進。在用一段短DNA片段替代另一段DNA時，他們的方法獲得了高達60%的成功率，這么高的成功率是前所未有的。研究人員在1月21日的《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上描述了他們的這項新技術(shù)。（更多詳細信息參見：Nature Biotechnology：實現(xiàn)前所未有的CRISPR基因編輯成功率）麻省總醫(yī)院的研究人員也在Nature雜志上發(fā)布了改良版CRISPR技術(shù)。他們通過改造Cas9酶大大減少了它與DNA的非特異性互作，將脫靶效率降低至無法檢測到的水平。

CRISPR-Cpf1能夠在crRNA的引導(dǎo)下在人類細胞中剪切目標DNA，被稱為是新一代的CRISPR基因組編輯系統(tǒng)。不過，人們對這個系統(tǒng)的作用機制還知之甚少。麻省總醫(yī)院、哈佛醫(yī)學院的研究人員解析了Cpf1核酸酶在人類細胞中的全基因組特異性，并將研究結(jié)果發(fā)布在6月27日的《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上。

Broad研究所遺傳干擾平臺（GPP）和微軟研究所的研究人員開發(fā)了一種預(yù)測模型。這種模型可以為人們揭示哪些單導(dǎo)向RNA （sgRNA）序列能夠與CRISPR-Cas9形成最佳組合，更有效地探查基因組秘密。這一研究小組將他們的方法報告在了本周的《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上，并準備通過Addgene公司向科研團體提供針對人類和小鼠基因組的sgRNAs優(yōu)選清單。

CRISPR先驅(qū)Jennifer A Doudna領(lǐng)導(dǎo)研究團隊揭示了CRISPR-Cas9剪切DNA時的關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)。在CRISPR-Cas系統(tǒng)中，Cas蛋白與小CRISPR RNA（crRNA）形成復(fù)合體，切割與RNA互補的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一個典型特征，基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用，研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結(jié)構(gòu)。

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