Cell,Death,Differ：時玉舫研究組發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病新機制

Cell,Death,Differ：時玉舫研究組發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病新機制

2016年08月27日訊 國際學(xué)術(shù)期刊《細胞死亡與分化》（Cell Death & Differentiation）在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所時玉舫研究組題為Spermidine Alleviates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis through Inducing Inhibitory Macrophages 的最新研究成果，揭示了亞精胺對實驗性自身腦脊髓炎的治療作用和機制。

自身免疫病是機體免疫系統(tǒng)發(fā)生偏差，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)開始錯誤地攻擊自身細胞和組織，從而造成器官功能損傷。這類疾病非常難以治愈，至今仍是臨床醫(yī)學(xué)的難題。在多發(fā)性硬化癥（MS）的發(fā)病過程中，免疫系統(tǒng)攻擊自身運動神經(jīng)髓鞘，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥以及脫髓鞘病變，多發(fā)于20-40歲的中青年人，目前該病在全球范圍內(nèi)約有數(shù)百萬患者，在我國MS病例呈迅速上升的趨勢。在對MS的經(jīng)典動物模型--實驗性自身反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）的研究中發(fā)現(xiàn)Th1、Th17細胞、巨噬細胞等對于EAE的發(fā)病均起著重要的作用。對此，機體高度進化的負反饋免疫調(diào)節(jié)機制參與了調(diào)整炎癥反應(yīng)和固有免疫，從而影響疾病的進程。其中，機體的多種代謝產(chǎn)物也具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。亞精胺是一種體內(nèi)氨基酸的中間代謝產(chǎn)物，為細胞生長所必需的多胺類物質(zhì)，并且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。然而，亞精胺的免疫調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明。

博士研究生楊茜等人在研究員時玉舫和副研究員曹巍的指導(dǎo)下發(fā)現(xiàn)，亞精胺可以顯著抑制EAE的發(fā)生和阻止EAE的進展。經(jīng)亞精胺治療后的EAE小鼠，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥細胞浸潤減少，脫髓鞘程度減輕，發(fā)病率降低。進一步研究表明，亞精胺改善EAE的癥狀并非直接作用于致病性T細胞，而主要是通過調(diào)控巨噬細胞的功能，進而抑制免疫反應(yīng)。

亞精胺一方面通過抑制巨噬細胞中NF-κB信號通路，影響抗原遞呈能力，降低炎癥反應(yīng)；另一方面，它通過上調(diào)精氨酸酶1的表達，促使巨噬細胞向抗炎性M2型轉(zhuǎn)化，并且通過精氨酸的消耗負反饋調(diào)節(jié)作用機制，發(fā)揮對EAE的治療作用。這些發(fā)現(xiàn)加深了對亞精胺參與和塑造機體免疫微環(huán)境的認識，尤其是調(diào)控炎癥狀態(tài)下巨噬細胞的活化狀態(tài)，為其在臨床中應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)和參考。

國外研究團隊發(fā)現(xiàn)，第一次懷孕和后期懷孕的免疫細胞作用不同！

PNAS：治療肥胖的激素可能增加敗血癥的風險Cell：腸道發(fā)炎和口腔健康有密切關(guān)聯(lián)外國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，壞血病的突變將促使新生兒疾病及造血功能障礙外國研究員發(fā)現(xiàn)：人類大腦基因促使猴子長出更大的大腦 懷孕需要生理性暴露于外來胎兒同種異體抗原，而且經(jīng)常會再次暴露于異源胎兒同種抗原。懷孕后的后果差異很大，有同種免疫和耐受性表型增加的證據(jù)。我們表明，懷孕引發(fā)了胎兒特異性母體CD8+ T細胞的積累及其在分娩后作為活化記憶池的持久性。在非生殖環(huán)境中，抗原再相遇會發(fā)生細胞溶解和強大的二次擴增潛能。相比之下，與PD-1和LAG-3表達增加相關(guān)的CD8+T細胞功能衰竭與隨后懷孕期間胎兒抗原的重新 *** 有關(guān)。PD-L1 / LAG-3中和釋放了胎兒特異性CD8+的活化T細胞，在繼發(fā)而非原發(fā)妊娠期間選擇性地導(dǎo)致胎兒浪費。

為了更全面地研究母親在懷孕期間對胎兒 *** 的免疫學(xué)反應(yīng)，將主要的組織相容性復(fù)合體（MHC）I類四聚體染色與四聚體陽性細胞富集相結(jié)合，以鑒定具有確定胎兒特異性的罕見內(nèi)源性母體CD8+T細胞。該方法利用了跟蹤內(nèi)源性母體T細胞的優(yōu)勢，但同時繞過了僅對一部分外周T細胞進行采樣所帶來的限制。通過重新定位這些工具，可以識別出分娩后仍然存在的由妊娠引發(fā)的胎兒特異性CD8+T細胞的獨特庫，并證明了其上下文特異性同種免疫與耐受性表型相關(guān)的分子基礎(chǔ)。

妊娠后具有胎兒特異性的母體CD8+T細胞持續(xù)存在

鑒于MHC單倍型等位基因中定義抗原的可用性有限，具有組成性細胞表面OVA表達的BALB / c（H-2d）雄性小鼠被用于在非轉(zhuǎn)基因C57BL / 6（H-2 b）雌性中進行同種異體妊娠（圖1 A）。這種交配方案將OVA轉(zhuǎn)化為替代胎兒抗原，并允許使用MHC I類四聚體染色和富集來鑒定內(nèi)源性，多克隆胎兒特異性（H-2Kb：OVA257-264）CD8+T細胞。使用這種方法，我們顯示懷孕在脾臟和周圍淋巴結(jié)的妊娠中期（胚胎日[E] 10.5）啟動了具有胎兒OVA特異性的母體CD8 + T細胞的約50倍擴增（圖1 B） 。與原始對照小鼠中具有相同特異性的細胞相比，這些細胞的數(shù)目在分娩后收縮，直到分娩后8周仍保持> 10倍的增加水平（圖1 B）。

還觀察到由胎兒抗原 *** 引發(fā)的母體CD8 + T細胞的表型轉(zhuǎn)移。在妊娠和分娩后，具有胎兒-OVA特異性的母體CD8 + T細胞顯示出更高的親和力，基于H-2K b：OVA四聚體染色強度和歸一化至TCR表達水平后的親和力，與原始對照中具有相同特異性的細胞相比小鼠（圖 1C）。懷孕期間和分娩后第21天，大多數(shù)胎兒OVA特異性CD8 + T細胞均為CD44 hi，表明有抗原經(jīng)歷（圖1D）。然而，CD62L的持續(xù)下調(diào)以及CCR7表達的增加模糊了進一步分類為中央或效應(yīng)記憶細胞的作用（圖1 D）。孕育的孕產(chǎn)婦CD8 + T細胞也顯示出明確的陰性共 *** 分子（包括PD-1和LAG-3）表達增加，而在分娩后表達仍保持升高，而其他表達，包括CTLA-4和TIM-3，懷孕期間沒有明顯變化，或者分娩后沒有持續(xù)變化（圖1 D）。因此，原發(fā)妊娠會引發(fā)胎兒特異性CD8 +的擴增 T細胞作為獨特的記憶庫而持久，并具有與活化和功能衰竭相關(guān)的分子的豐富表達。

具有胎兒特異性的母體CD8 + T細胞在妊娠期間擴增并在分娩后持續(xù)存在。(圖源：Sciencedirect)

母體記憶CD8+T細胞具有細胞溶解能力和效應(yīng)細胞因子的產(chǎn)生

為了進一步研究胎兒OVA特異性CD8 + T細胞的功能特性，評估了它們產(chǎn)生細胞因子的潛力。生產(chǎn)規(guī)范效應(yīng)細胞因子干擾素γ（IFN-γ），腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）H-2K b：OVA CD8 +以下佛波醇12-豆蔻酸酯13- T細胞與原始或妊娠中期妊娠小鼠中具有相同特異性的細胞相比，分娩后第21天時乙酸-乙酸（PMA）-離子霉素的 *** 顯著增加（圖1 E）。孕婦CD8 +與胎兒期間具有相同特異性的細胞相比，具有胎兒OVA特異性的T細胞在分娩后同時產(chǎn)生多種效應(yīng)細胞因子方面也表現(xiàn)出更高的多功能性（圖1 E）。額外的時程分析顯示，分娩后早期細胞因子的產(chǎn)生甚至更高，在分娩后第21天穩(wěn)定下來（圖1 F）。因此，鑒于在這個時間點記憶細胞的功能穩(wěn)定，后續(xù)實驗著重于產(chǎn)后第21天。

具有胎兒特異性的母體CD8 + T細胞在妊娠期間擴增并在分娩后持續(xù)存在。(圖源：Sciencedirect)

為了更準確地說明母親如何對完整的胎兒細胞進行免疫反應(yīng)，評估了對來自Act-OVA轉(zhuǎn)基因小鼠的過繼轉(zhuǎn)移脾細胞的持久性和CD8 + T細胞反應(yīng)（圖2 A）。我們發(fā)現(xiàn)，表達OVA的雄性與先前懷孕有關(guān)的雌性中，OVA +細胞的清除速度明顯加快（圖2 B）。轉(zhuǎn)移后第7天，與初次控制的小鼠相比，在先前懷孕的母親中，表達OVA的雄性導(dǎo)致OVA +（CD45.1 +）細胞減少了約100倍（圖2 B）。加速拒絕OVA +這些細胞與表達OVA的雄性有先孕的小鼠中胎兒OVA特異性CD8 + T細胞積累的增加平行（圖2 C）。這些差異反映了加速的擴增，并且不能解釋為與OVA +細胞轉(zhuǎn)移之前的原始小鼠相比，產(chǎn)后小鼠的OVA特異性CD8 + T細胞數(shù)量增加，因為與原始小鼠相比，產(chǎn)后的倍數(shù)擴展明顯增加（圖2 C）。

妊娠為首的CD8 + T細胞具有細胞溶解作用，并具有強大的繼發(fā)性再增殖能力(圖源：Sciencedirect)

繼發(fā)妊娠期間的母體記憶CD8+T細胞低反應(yīng)性

先前懷孕的這些保護性益處以伴侶特異性的方式發(fā)生，這表明，盡管懷孕引發(fā)了對胎兒抗原的同種免疫，但在隨后的懷孕期間，致耐受性反應(yīng)得以恢復(fù)甚至增強。在非生殖環(huán)境中評估胎兒alloantigen反應(yīng)時，為什么致敏性占主導(dǎo)地位的一種解釋是，需要特定于妊娠的生理變化才能 *** 孕前孕育的孕產(chǎn)婦免疫成分的低反應(yīng)性表型。

通過比較記憶CD8+T細胞中這些功能的分子基礎(chǔ)，通過比較其細胞內(nèi)力消耗分子的表達與繼發(fā)妊娠期間胎兒抗原的再 *** 來進行比較。與繼發(fā)妊娠期間胎兒OVA重新 *** 導(dǎo)致CD8+T細胞的鈍性擴張相一致，這些細胞顯示PD-1，LAG-3和CTLA-4共抑制分子的表達急劇增加，而TIM-3保持不變。

PD-1和LAG-3在繼發(fā)妊娠期間選擇性損害CD8+T細胞活化

為了研究繼發(fā)妊娠期間母體T細胞選擇性擴增PD-1和LAG-3表達的功??能意義，評估了中和這些分子對妊娠結(jié)局和胎兒特異性CD8 + T細胞積累的影響（圖5 A ）。在繼發(fā)而非初次妊娠期間的妊娠中期給予PD-L1和LAG-3中和抗體會在72小時內(nèi)引發(fā)幾乎完全的胎兒流失（圖5 B）。

PD-L1 / LAG-3功能性封鎖引起的胎兒浪費與繼發(fā)妊娠期間胎兒OVA特異性CD8 + T細胞的釋放重新釋放有關(guān)，但對初次妊娠期間這些細胞的積累沒有顯著影響（圖 5C）。同時中和PD-L1和LAG-3是必需的，因為在二次妊娠期間，僅用抗PD-L1或LAG的中和抗體治療小鼠時，既不會浪費胎兒，也不會發(fā)生具有胎兒OVA特異性的CD8 + T細胞的再擴增。-3（圖5 B和5C）。

PD-1和LAG-3 在繼發(fā)妊娠期間選擇性限制胎兒特異性CD8 + T細胞的再生。(圖源：Sciencedirect)

繼發(fā)妊娠期間由PD-L1 / LAG-3阻滯觸發(fā)的胎兒浪費直接反映了胎兒特異性CD8 + T細胞的釋放活化，因為隨著母體CD8 + T細胞與PD-L1 的共同消耗，胎兒浪費顯著減少/ LAG-3功能封鎖（圖5 D）。

這些妊娠結(jié)局表型也無法通過潛在的PD-L1 / PD-1或LAG-3直接 *** CD4 + T細胞來解釋，因為這些細胞的耗竭都不會推翻CD8中PD-L1 / LAG-3阻滯誘導(dǎo)的胎兒浪費+ T細胞充足的小鼠，或CD8 + T細胞枯竭的小鼠中對胎兒浪費的保護（圖5）D）。

然而，由PD-L1 / LAG-3阻斷觸發(fā)的胎兒浪費在MHC相同的雄性和雌性小鼠繼發(fā)的同基因妊娠中被推翻，這表明母體對遺傳上異源的胎兒同種異體抗原的識別驅(qū)動了CD8 + T細胞功能衰竭的必要性防止胎兒流失（圖5 E和5F）。

因此，與原代同種異體妊娠相比，繼發(fā)性胎兒 *** 下的母體CD8 + T細胞表達的PD-1和LAG-3水平逐漸升高，并且這些共抑制分子通過抑制母體的記憶活化來防止胎兒浪費CD8 +T細胞是由先前的懷孕引發(fā)的。這些結(jié)果突出了與初次妊娠相比，初次妊娠和胎兒T細胞對胎兒抗原 *** 反應(yīng)如何達到耐受性的獨特策略。

結(jié)果

懷孕仍然是免疫學(xué)上的奇跡和悖論。盡管有許多機制可以保護同種異體胎兒組織免于過早排斥，但是我們關(guān)于妊娠如何在免疫學(xué)上起作用的核心知識仍然是基本知識。在這方面，可以通過研究均等來發(fā)現(xiàn)重要的線索，以及與活化的免疫細胞相比，幼稚與胎兒抗原 *** 反應(yīng)的潛在差異。

與對外源性微生物入侵者俱有特異性的保護性記憶免疫細胞的加速活化和擴增相一致，胎盤哺乳動物也可能發(fā)展了目的論上保守的途徑，以記住有益的胎兒同種異體抗原并在隨后的暴露過程中增強胎兒的耐受性。

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