2016年08月31日訊 狹義上講,測序就是指利用技術(shù)手段確定一段核糖核酸或脫氧核糖核酸里面的堿基順序,例如DNA中的ATCG如何排列。廣義上的測序不僅需要確定DNA中的ATCG堿基順序,還包括這些堿基與整個基因組的關(guān)系,堿基變化給個體帶來的有利或有害的影響。
最早的時候,基因測序只能應(yīng)用于科研之上,是遺傳學(xué)及分子生物學(xué)一個重要的科研工具。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,測序價格大大降低及測序儀的能力越來越高,測序技術(shù)應(yīng)該不僅僅局限于科研市場,越來越多的人想要將測序這種分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到面向大眾的普通消費市場,特別是醫(yī)療市場和臨床市場,一旦測序技術(shù)在這些市場進行推廣應(yīng)用,將會帶來更大的發(fā)展。
狹義上講,測序就是指利用技術(shù)手段確定一段核糖核酸或脫氧核糖核酸里面的堿基順序,例如DNA中的ATCG如何排列。廣義上的測序不僅需要確定DNA中的ATCG堿基順序,還包括這些堿基與整個基因組的關(guān)系,堿基變化給個體帶來的有利或有害的影響。
一般現(xiàn)在市場上的測序分為兩種,研究性測序:對某個物種的基因組圖譜進行測序或者針對某個疾病的群體進行整體序列研究;應(yīng)用性測序:測定個人基因組對疾病等進行預(yù)測。
為什么現(xiàn)在還需要不斷的測序:
首先是遺傳信息是所有物種的遺傳基礎(chǔ),所有表型都是遺傳和環(huán)境的共同作用,但遺傳是根本,環(huán)境是起影響作用;遺傳信息里,作為大多數(shù)物種遺傳物質(zhì)的DNA當(dāng)然應(yīng)該首要關(guān)注,所以需要對物種的基因組進行測定。地球上如此多的物種,目前尚有大量物種未被測序,所以還一直進行測序。
同一物種的個體,是有異質(zhì)性,也就是有個體差異的,正因為這種差異,才會有進化,對有經(jīng)濟價值的物種也才有育種的可能。所以,這就要對同一物種不同個體(即群體)進行測序,測序規(guī)模越大,所能發(fā)現(xiàn)的有趣基因越多。
健康診斷,目前已經(jīng)有分子診斷、基因診斷,而基因組診斷則是更全面,更本質(zhì)的診斷,所以將來會出現(xiàn)人人基因組的局面,那時會測定每個人的基因組,依據(jù)個人特點的基因組進行健康管理、疾病治療或指導(dǎo)用藥。
測序方法:
一代測序:
即Sanger測序法,核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 種單脫氧核苷三磷酸(dNTP,其中的一種用放射性P32標(biāo)記)存在條件下復(fù)制時,在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因為雙脫氧核苷沒有3’-OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長,若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個泳道進行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段,長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3’端的雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。
二代測序(NGS):
將基因組DNA打碎成約100-200個堿基的小片段,在片段的兩個末端加上接頭 ( adapter )。將DNA片段變成單鏈后通過接頭與芯片表面的引物堿基互補而使一端被固定在芯片上。另外一端隨機和附近的另外一個引物互補,也被固定住,形成橋狀結(jié)構(gòu)。通過30輪擴增反應(yīng),每個單分子被擴增大約1000 倍,成為單克隆的DNA簇,隨后將DNA 簇線性化。在下一步合成反應(yīng)中,加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。在DNA合成時,每一個核苷酸加到引物末端時都會釋放出焦磷酸鹽,激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反應(yīng)板表面,在讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類后,將這些熒光基團化學(xué)切割,恢復(fù)3’端黏性,隨后添加第二個核苷酸。如此重復(fù)直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣,統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果, 就可以得知每個模板DNA片段的序列。
三代測序:
DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記4種堿基(dNTP),在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要與酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵是將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW(零模波導(dǎo)孔)原理:在一個反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實時反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔,即 ZMW(零模波導(dǎo)孔)外徑 100多納米,比檢測激光波長?。〝?shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區(qū),能量被限制在一個小范圍里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現(xiàn)將背景降到最低。
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