2016年09月05日訊 最近在《Journal of Cell Biology》發(fā)表的一項(xiàng)研究中,美國(guó)麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家,揭示了“CRISPR-Cas9機(jī)器在活細(xì)胞內(nèi)如何運(yùn)作”的重要新細(xì)節(jié),對(duì)于開(kāi)發(fā)使用強(qiáng)大基因編輯工具的治療方法,具有重要的意義。
本文通訊作者、生物化學(xué)與分子藥理學(xué)教授Thoru Pederson博士說(shuō):“關(guān)于‘CRISPR-Cas9復(fù)合物如何在活細(xì)胞的基因組周?chē)奶幓顒?dòng)并發(fā)現(xiàn)其靶標(biāo)’的細(xì)節(jié),我們了解甚少。在這項(xiàng)研究中,我們了解到這臺(tái)機(jī)器是如何工作的,這對(duì)于試圖開(kāi)發(fā)基因編輯工具用于實(shí)驗(yàn)室和臨床的研究者來(lái)說(shuō),是非常重要的和有用的?!?/p>
作為該細(xì)菌免疫系統(tǒng)(防止病毒入侵)的一個(gè)組件,CRISPR-Cas9復(fù)合物是一種強(qiáng)大的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR-Cas9適于在實(shí)驗(yàn)室里,它比以前的技術(shù)更有效和精確,因?yàn)榭茖W(xué)家們能找到方法,快速地編程和傳遞它,以選擇性地編輯用于研究的特定基因序列。為了切割一段雙鏈DNA,CRISPR-Cas9利用一段大約20個(gè)堿基對(duì)的向?qū)NA,來(lái)靶定基因組的特定靶區(qū)域,然后,Cas9復(fù)合物將進(jìn)行切割。這使得科學(xué)家能夠切除基因組中的基因序列,或向基因組中插入基因序列。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞內(nèi)如何運(yùn)作的根本動(dòng)力學(xué),我們還不清楚,一些傳遞系統(tǒng)和技術(shù)已經(jīng)比其他的更為成功。為了觀察CRISPR-Cas9系統(tǒng)在一個(gè)活細(xì)胞內(nèi)是如何運(yùn)作的,Pederson博士和同事們開(kāi)發(fā)了一種技術(shù),能用不同的熒光分子來(lái)標(biāo)記導(dǎo)向RNA和Cas9元件,這樣就可以同時(shí)跟蹤它們。
他們發(fā)現(xiàn),向?qū)NA--當(dāng)不結(jié)合Cas9時(shí),是極其短暫的。當(dāng)Cas9和向?qū)NA進(jìn)行組裝時(shí),該復(fù)合物要穩(wěn)定得多,大約有一半其一生(大概十五分鐘)是在細(xì)胞核內(nèi),其余的則更為穩(wěn)定。
本文共同第一作者、Pederson實(shí)驗(yàn)室的研究專家馬涵慧(Hanhui Ma)博士指出:“Cas9可使導(dǎo)向RNA穩(wěn)定。如果你分別將向?qū)NA和Cas9傳遞入細(xì)胞,以讓它們進(jìn)行組裝,它將不會(huì)那么的有效,因?yàn)橐恍┫驅(qū)NA會(huì)降解。如果你把它們都傳遞到細(xì)胞內(nèi),已經(jīng)組裝,你會(huì)看到更多的活性。”馬博士早年畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。
其他的研究成員--包括RNA療法研究所助理教授David Grunwald博士,Grunwald實(shí)驗(yàn)室博士后Li-Chun Tu博士發(fā)現(xiàn),通過(guò)Cas9引導(dǎo)性RNA復(fù)合物的靶標(biāo)停留持續(xù)時(shí)間,決定著DNA是否將被切割。當(dāng)向?qū)NA序列與靶DNA序列完全匹配時(shí),這種Cas9引導(dǎo)性RNA復(fù)合物在離開(kāi)之前仍然結(jié)合長(zhǎng)達(dá)兩小時(shí)的時(shí)間,同時(shí)切割完成。如果是不匹配的引導(dǎo)性RNA靶向DNA序列,該復(fù)合物只會(huì)持續(xù)幾分鐘的時(shí)間,并且切割受損。
馬博士說(shuō),知道了這一點(diǎn),科學(xué)家就有可能通過(guò)數(shù)學(xué)方法,根據(jù)CRISPR位于基因組上多久,來(lái)預(yù)測(cè)脫靶切割可能發(fā)生在哪里。馬博士補(bǔ)充說(shuō):“我們?nèi)匀徊恢繡RISPR的規(guī)則。每個(gè)人都想知道,當(dāng)它進(jìn)入一個(gè)活細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生什么。這項(xiàng)研究有助于寫(xiě)一篇《操作手冊(cè)》?!?/p>
在今年4月,這個(gè)研究小組開(kāi)發(fā)出了一項(xiàng)利用CRISPR/Cas9的新技術(shù):CRISPRainbow,它使得研究人員能夠在活細(xì)胞中標(biāo)記和追蹤7個(gè)不同的基因組位點(diǎn)。這一標(biāo)記系統(tǒng)將成為實(shí)時(shí)研究基因組結(jié)構(gòu)的一個(gè)寶貴的工具。
而在2015年《PNAS》發(fā)表的一項(xiàng)研究中,馬涵慧博士帶領(lǐng)研究人員,利用來(lái)自三種細(xì)菌直系同源物的催化失活Cas核酸內(nèi)切酶(dCas9),設(shè)計(jì)了一種基于CRISPR的多色熒光標(biāo)記系統(tǒng),可特定而有區(qū)別地同時(shí)標(biāo)記不同對(duì)的染色體位點(diǎn)。每對(duì)dCas9-熒光蛋白和同源單導(dǎo)向RNAs(sgRNAs),可有效地標(biāo)記人活細(xì)胞內(nèi)的幾個(gè)靶位點(diǎn)。
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