首個(gè)真核電壓門控鈣離子通道近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)(施一公的得意學(xué)生有哪些)

首個(gè)真核電壓門控鈣離子通道近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)

2016年09月06日訊 2016年9月1日，清華大學(xué)生命學(xué)院兼職教授顏寧研究組在《自然》（Nature）雜志發(fā)表題為《電壓門控鈣離子Cav1.1通道3.6埃分辨率結(jié)構(gòu)》（Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 angstrom resolution）的研究長文（Research Article），報(bào)道了首個(gè)真核電壓門控鈣離子通道的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，為理解為數(shù)眾多的具有重要生理和病理功能的電壓門控鈣離子和鈉離子通道的工作機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

電壓門控離子通道是一大類位于細(xì)胞膜上、通過感受電信號控制離子跨膜進(jìn)出細(xì)胞的蛋白質(zhì)。上世紀(jì)四五十年代，英國科學(xué)家霍奇金和赫胥黎發(fā)現(xiàn)了動作電位；之后發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉離子通道（Nav通道）引發(fā)動作電位，而電壓門控鉀離子通道（Kv通道）則能使細(xì)胞去極化，恢復(fù)至靜息電位。五十年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在沒有鈉離子的情況下，依賴鈣離子也能產(chǎn)生動作電位，這是由電壓門控鈣離子通道（Cav通道）介導(dǎo)的生理過程。鈣離子本身是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的第二信使，通過Cav通道，將細(xì)胞膜兩側(cè)的電信號變化轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)部的化學(xué)信號，引起一系列反應(yīng)，包括肌肉收縮、腺體分泌、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等。80年代，首個(gè)Cav通道的基因被克隆，序列分析顯示，它與Nav通道的序列高度相似。

電壓門控離子通道的功能異?；蛭蓙y與一系列疾病相關(guān)，比如Nav1.7直接與痛覺相關(guān)，其異常激活或失活會導(dǎo)致異常疼痛或者無法感知痛覺，已知Nav1.7突變會導(dǎo)致紅斑性肢痛癥；Nav1.4或Cav1.1突變會導(dǎo)致低鉀性周期癱瘓；Nav1.1或Cav2.1突變導(dǎo)致變異型家族偏癱型偏頭痛；Nav、Cav以及Kv功能異常則可能導(dǎo)致心率紊亂、癲癇等。電壓門控離子通道目前是僅次于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的第二大藥物靶點(diǎn)。外科手術(shù)用到的麻醉劑通過抑制Nav通道起作用；Cav通道則是降壓藥物的靶點(diǎn)。因此，對于電壓門控離子通道的研究尤其是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究具有重要的生理學(xué)和藥理學(xué)意義。

與Kv通道近20年的結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)展相比，Nav和Cav通道的結(jié)構(gòu)姍姍來遲，主要是因?yàn)榕c由同源四聚體構(gòu)成的Kv通道不同，真核生物Nav和Cav通道由一條具有1500-2000個(gè)氨基酸的肽鏈折疊成四個(gè)類似但不盡相同的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有六次跨膜螺旋，相鄰結(jié)構(gòu)域之間由長度各異的序列連接。這一特點(diǎn)使得蛋白的重組表達(dá)和結(jié)晶難度相比Kv通道都大大增加。因此，一直以來僅有納米分辨率的真核生物Nav和Cav通道冷凍電鏡影像報(bào)道，無法揭示任何結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)信息。近幾年，隨著冷凍電鏡技術(shù)的革新，利用該技術(shù)獲得近原子分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。顏寧研究組利用清華大學(xué)的冷凍電鏡平臺，首次揭示了真核生物Cav通道的結(jié)構(gòu)。

Cav1.1是哺乳動物中10個(gè)電壓門控鈣離子通道中的第一個(gè)被鑒定的，主要分布在在骨骼肌，它的主要功能是在肌肉細(xì)胞接受運(yùn)動神經(jīng)元信號產(chǎn)生動作電位時(shí)感受膜電勢的變化，進(jìn)而激活與其直接作用的下游肌質(zhì)網(wǎng)膜上的高通量鈣離子通道RyR1，促使鈣離子快速大量釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引起肌肉的收縮，該過程稱為興奮-收縮偶聯(lián)（excitation-contraction coupling，EC coupling），Cav1.1和RyR1是引發(fā)這個(gè)過程最為關(guān)鍵的兩個(gè)膜蛋白。 2015年1月，顏寧研究組在《自然》報(bào)道了RyR1的3.8埃冷凍電鏡結(jié)構(gòu)；同年12月，她們在《科學(xué)》上報(bào)道了Cav1.1的4.2埃電鏡結(jié)構(gòu)。但是由于分別率所限，盡管該結(jié)構(gòu)首次揭示了Cav1.1復(fù)合物中各個(gè)輔助亞基（包括α2σ亞基、β亞基和γ亞基）與離子通道亞基（α1亞基）的相互作用區(qū)域，以及離子通道亞基內(nèi)部同源結(jié)構(gòu)域的排布，但是大部分區(qū)域無法精確到氨基酸側(cè)鏈，因而不能對蛋白的狀態(tài)進(jìn)行深入的分析。在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中，4埃的分辨率往往是一個(gè)分水嶺。要想清晰地分辨出蛋白質(zhì)氨基酸的側(cè)鏈，往往需要高于4埃的分辨率（數(shù)字越小分辨率越高），而其難度也相應(yīng)增加。

在剛剛發(fā)表的《自然》論文中，顏寧研究組通過多次嘗試，成功優(yōu)化了蛋白的制樣方法，從而獲得了高質(zhì)量的冷凍電鏡成像。他們從近萬張冷凍電鏡照片中挑出超過一百萬的蛋白單顆粒，利用單顆粒三維重構(gòu)的方法最終獲得了整體3.6埃的近原子分辨率結(jié)構(gòu)。

新報(bào)道的3.6埃電鏡結(jié)構(gòu)相比之前4.2埃盡管在數(shù)字上看似進(jìn)步不大，卻有著質(zhì)的飛越。在該結(jié)構(gòu)中，大部分氨基酸的側(cè)鏈能夠被清晰分辨，從而可以據(jù)此搭建出準(zhǔn)確和完整的結(jié)構(gòu)模型。新的結(jié)構(gòu)揭示了大量新信息，更新了我們對電壓門控鈣離子通道的認(rèn)識，比較具有代表性的特征包括：1）該結(jié)構(gòu)展示了一個(gè)處于封閉構(gòu)象的鈣離子通道，而四個(gè)電壓感受器（VSD）都處于去極化狀態(tài)，因而判斷該結(jié)構(gòu)展示的是一個(gè)“去活化”的狀態(tài)；2）輔助性亞基α2σ的結(jié)構(gòu)被基本完整構(gòu)建，其與離子通道亞基α1的相互作用也完全呈現(xiàn)；3）輔助性亞基α2σ是一次跨膜的蛋白還是膜錨定蛋白在之前一直存有爭議，通過新的結(jié)構(gòu)并結(jié)合質(zhì)譜分析，可以判斷出α2σ亞基為膜錨定蛋白；4）該結(jié)構(gòu)解析了更為清晰的離子選擇性過濾器，在離子選擇性過濾器中甚至還可以看到兩團(tuán)相連的密度，很有可能是結(jié)合的鈣離子；5）通過三維分類，可以得到兩個(gè)構(gòu)象不同的結(jié)構(gòu)。對比兩個(gè)結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)側(cè)的β亞基發(fā)生很大的構(gòu)象變化，該構(gòu)象變化可能是引起肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

至此，顏寧教授研究組已經(jīng)成功解析了肌肉興奮-收縮偶聯(lián)通路上的兩個(gè)關(guān)鍵膜蛋白Cav1.1以及RyR1的結(jié)構(gòu)，從而為理解這一基本生理過程的分子機(jī)理打下重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。更重要的是，高分辨的Cav1.1結(jié)構(gòu)不僅揭示了Cav通道的結(jié)構(gòu)，也為理解目前仍未有高分辨率結(jié)構(gòu)的真核Nav通道的結(jié)構(gòu)與機(jī)理提供了重要的模板，可以利用現(xiàn)有Cav1.1的結(jié)構(gòu)嘗試解釋此前半個(gè)多世紀(jì)積累起來的有關(guān)Cav和Nav通道的大量生物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)，并且為利用結(jié)構(gòu)進(jìn)行新型藥物設(shè)計(jì)、篩選和優(yōu)化提供了重要基礎(chǔ)。

生命學(xué)院CLS項(xiàng)目五年級博士生吳建平、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖中心卓越學(xué)者閆湞以及生命學(xué)院CLS項(xiàng)目二年級博士生李張強(qiáng)為本文共同第一作者；生命學(xué)院二年級博士生錢興洋在輪轉(zhuǎn)期間參與該課題實(shí)驗(yàn)；醫(yī)學(xué)院周強(qiáng)副教授為數(shù)據(jù)處理提供了建議和幫助。北京生命科學(xué)研究所董夢秋研究員和盧珊參與質(zhì)譜鑒定的合作。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心（北京）、聯(lián)想高性能計(jì)算、以及榮之聯(lián)董事長王東輝先生的支持。顏寧教授為本文通訊作者，她是清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心研究員、膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室成員、拜耳講席教授，本工作獲得科技部重大科學(xué)研究計(jì)劃專項(xiàng)和基金委創(chuàng)新群體支持。

施一公的得意學(xué)生有哪些

施一公的得意學(xué)生有哪些：顏寧。

顏寧介紹如下：

顏寧，女，1977年11月出生于山東省濟(jì)南市章丘區(qū)普集街道博平村，結(jié)構(gòu)生物學(xué)家，深圳醫(yī)學(xué)科學(xué)院院長，深圳灣實(shí)驗(yàn)室主任，美國國家科學(xué)院外籍院士，美國藝術(shù)與科學(xué)院外籍院士。

顏寧經(jīng)歷介紹如下：

2017年5月7日，接受美國普林斯頓大學(xué)邀請，受聘為普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系雪莉·蒂爾曼終身講席教授；同年5月起，任清華大學(xué)兼職教授。2019年，當(dāng)選美國國家科學(xué)院外籍院士。2021年，當(dāng)選美國藝術(shù)與科學(xué)院外籍院士.

2022年12月10日，深圳醫(yī)學(xué)科學(xué)院（籌）揭牌，顏寧獲發(fā)聘書，出任院長。2023年3月，擔(dān)任深圳灣實(shí)驗(yàn)室主任，4月15日，被選聘為新一屆的中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)部委員。

顏寧的成就介紹如下：

顏寧自2007年10月回中國組建實(shí)驗(yàn)室以來，一直致力于結(jié)構(gòu)生物學(xué)中膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究。2014年，她率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在世界上首次解析了人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的三維晶體結(jié)構(gòu)，2015年進(jìn)一步獲得了具備更多構(gòu)象的GLUT3結(jié)合底物和抑制劑的超高分辨率結(jié)構(gòu)。

從而清晰揭示了葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)這一基本細(xì)胞過程的分子基礎(chǔ)。她還對離子通道結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域做出重要貢獻(xiàn)，解析了電壓門控鈉離子通道的晶體結(jié)構(gòu)，最近又利用最新冷凍電鏡技術(shù)獲得了最大鈣離子通道RyR1的高分辨率結(jié)構(gòu)。

顏寧在膜蛋白，特別是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域取得了一系列成果，這其中包括具有里程碑意義的人類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的三維晶體結(jié)構(gòu)；她在離子通道研究領(lǐng)域也卓有建樹，為鈉離子通道研究貢獻(xiàn)了主要結(jié)構(gòu)之一。

求畢業(yè)論文超光學(xué)分辨率的NSOM(近場掃描光學(xué)顯微鏡)探討，的文獻(xiàn)綜述

　　高分辨率光學(xué)顯微術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用

　　【摘要】 提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究主要集中在兩個(gè)方面進(jìn)行，一是利用經(jīng)典方法提高各種條件下的空間分辨率，如用于厚樣品研究的SPIM技術(shù)，用于快速測量的SHG技術(shù)以及用于活細(xì)胞研究的MPM技術(shù)等。二是將最新的非線性技術(shù)與高數(shù)值孔徑測量技術(shù)（如STED和SSIM技術(shù)）相結(jié)合。生物科學(xué)研究離不開超高分辨率顯微術(shù)的技術(shù)支撐，人們迫切需要更新顯微術(shù)來適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的要求。近年來研究表明，光學(xué)顯微鏡的分辨率已經(jīng)成功突破200nm橫向分辨率和400nm軸向分辨率的衍射極限。高分辨率乃至超高分辨率光學(xué)顯微術(shù)的發(fā)展不僅在于技術(shù)本身的進(jìn)步，而且它將會極大促進(jìn)生物樣品的研究，為亞細(xì)胞級和分子水平的研究提供新的手段。

　　【關(guān)鍵詞】 光學(xué)顯微鏡；高分辨率；非線性技術(shù)；納米水平

　　在生物學(xué)發(fā)展的歷程中顯微鏡技術(shù)的作用至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的突破性發(fā)展。對固定樣品和活體樣品的生物結(jié)構(gòu)和過程的觀察，使得光學(xué)顯微鏡成為絕大多數(shù)生命科學(xué)研究的必備儀器。隨著生命科學(xué)的研究由整個(gè)物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細(xì)節(jié)的能力已經(jīng)成為一個(gè)非常關(guān)鍵的技術(shù)問題。光學(xué)顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率極限的歷史。在400～760nm的可見光范圍內(nèi)，顯微鏡的分辨極限大約是光波的半個(gè)波長，約為200nm，而最新取得的研究成果所能達(dá)到的極限值為20～30nm。本文主要從高分辨率三維顯微術(shù)和高分辨率表面顯微術(shù)兩個(gè)方面，綜述高分辨率光學(xué)顯微鏡的各種技術(shù)原理以及近年來在突破光的衍射極限方面所取得的研究進(jìn)展。

　　1 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率

　　光學(xué)顯微鏡圖像的大小主要取決于光線的波長和顯微鏡物鏡的有限尺寸。類似點(diǎn)源的物體在像空間的亮度分布稱為光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function, PSF)。因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的特點(diǎn)和發(fā)射光的性質(zhì)決定了光學(xué)顯微鏡不是真正意義上的線性移不變系統(tǒng)，所以PSF通常在垂直于光軸的x-y平面上呈徑向?qū)ΨQ分布，但沿z光軸方向具有明顯的擴(kuò)展。由Rayleigh判據(jù)可知，兩點(diǎn)間能夠分辨的最小間距大約等于PSF的寬度。

　　根據(jù)Rayleigh判據(jù)，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限由以下公式表示[1]：

　　橫向分辨率(x-y平面)：dx，y=■

　　軸向分辨率(沿z光軸)：dz=■

　　可見，光學(xué)顯微鏡分辨率的提高受到光波波長λ和顯微鏡的數(shù)值孔徑N.A等因素的制約；PSF越窄，光學(xué)成像系統(tǒng)的分辨率就越高。為提高分辨率，可通過以下兩個(gè)途徑：（1）選擇更短的波長；（2）為提高數(shù)值孔徑, 用折射率很高的材料。

　　Rayleigh判據(jù)是建立在傳播波的假設(shè)上的，若能夠探測非輻射場，就有可能突破Rayleigh判據(jù)關(guān)于衍射壁壘的限制。

　　2 高分辨率三維顯微術(shù)

　　在提高光學(xué)顯微鏡分辨率的研究中，顯微鏡物鏡的像差和色差校正具有非常重要的意義。從一般的透鏡組合方式到利用光闌限制非近軸光線，從穩(wěn)定消色差到復(fù)消色差再到超消色差，都明顯提高了光學(xué)顯微鏡的成像質(zhì)量。最近Kam等[2]和Booth等[3]應(yīng)用自適應(yīng)光學(xué)原理，在顯微鏡像差校正方面進(jìn)行了相關(guān)研究。自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)由波前傳感器、可變形透鏡、計(jì)算機(jī)、控制硬件和特定的軟件組成，用于連續(xù)測量顯微鏡系統(tǒng)的像差并進(jìn)行自動校正。 一般可將現(xiàn)有的高分辨率三維顯微術(shù)分為3類：共聚焦與去卷積顯微術(shù)、干涉成像顯微術(shù)和非線性顯微術(shù)。

　　2.1 共聚焦顯微術(shù)與去卷積顯微術(shù) 解決厚的生物樣品顯微成像較為成熟的方法是使用共聚焦顯微術(shù)(confocal microscopy) [4]和三維去卷積顯微術(shù)(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它們都能在無需制備樣品物理切片的前提下，僅利用光學(xué)切片就獲得樣品的三維熒光顯微圖像。

　　共聚焦顯微術(shù)的主要特點(diǎn)是，通過應(yīng)用探測針孔去除非共焦平面熒光目標(biāo)產(chǎn)生的熒光來改善圖像反差。共聚焦顯微鏡的PSF與常規(guī)顯微鏡的PSF呈平方關(guān)系，分辨率的改善約為■倍。為獲得滿意的圖像，三維共聚焦技術(shù)常需使用高強(qiáng)度的激發(fā)光，從而導(dǎo)致染料漂白，對活生物樣品產(chǎn)生光毒性。加之結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴，從而使應(yīng)用在一定程度上受到了限制。

　　3-DDM采用軟件方式處理整個(gè)光學(xué)切片序列，與共聚焦顯微鏡相比，該技術(shù)采用低強(qiáng)度激發(fā)光，減少了光漂白和光毒性，適合對活生物樣品進(jìn)行較長時(shí)間的研究。利用科學(xué)級冷卻型CCD傳感器同時(shí)探測焦平面與鄰近離焦平面的光子，具有寬的動態(tài)范圍和較長的可曝光時(shí)間，提高了光學(xué)效率和圖像信噪比。3-DDM拓展了傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡的應(yīng)用領(lǐng)域受到生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[6]。

　　2.2 選擇性平面照明顯微術(shù) 針對較大的活生物樣品對光的吸收和散射特性，Huisken[7]等開發(fā)了選擇性平面照明顯微術(shù)(selective plane illumination microscopy，SPIM)。與通常需要將樣品切割并固定在載玻片上的方式不同，SPIM能在一種近似自然的狀態(tài)下觀察2～3mm的較大活生物樣品。SPIM通過柱面透鏡和薄型光學(xué)窗口形成超薄層光，移動樣品獲得超薄層照明下切片圖像，還可通過可旋轉(zhuǎn)載物臺對樣品以不同的觀察角度掃描成像，從而實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的三維圖像重建。因?yàn)槭褂贸庸?，SPIM降低了光線對活生物樣品造成的損傷，使完整的樣品可繼續(xù)存活生長，這是目前其他光學(xué)顯微術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的。SPIM技術(shù)的出現(xiàn)為觀察較大活樣品的瞬間生物現(xiàn)象提供了合適的顯微工具，對于發(fā)育生物學(xué)研究和觀察細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)具有特別意義。

　　2.3 結(jié)構(gòu)照明技術(shù)和干涉成像 當(dāng)熒光顯微鏡以高數(shù)值孔徑的物鏡對較厚生物樣品成像時(shí)，采用光學(xué)切片是一種獲得高分辨3D數(shù)據(jù)的理想方法，包括共聚焦顯微鏡、3D去卷積顯微鏡和Nipkow 盤顯微鏡等。1997年由Neil等報(bào)道的基于結(jié)構(gòu)照明的顯微術(shù)，是一種利用常規(guī)熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片的新技術(shù)，并可獲得與共聚焦顯微鏡一樣的軸向分辨率。干涉成像技術(shù)在光學(xué)顯微鏡方面的應(yīng)用1993年最早由Lanni等提出，隨著I5M、HELM和4Pi顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用得到了進(jìn)一步發(fā)展。與常規(guī)熒光顯微鏡所觀察的熒光相比，干涉成像技術(shù)所記錄的發(fā)射熒光攜帶了更高分辨率的信息。（1）結(jié)構(gòu)照明技術(shù)：結(jié)合了特殊設(shè)計(jì)的硬件系統(tǒng)與軟件系統(tǒng)，硬件包括內(nèi)含柵格結(jié)構(gòu)的滑板及其控制器，軟件實(shí)現(xiàn)對硬件系統(tǒng)的控制和圖像計(jì)算。為產(chǎn)生光學(xué)切片，利用CCD采集根據(jù)柵格線的不同位置所對應(yīng)的原始投影圖像，通過軟件計(jì)算，獲得不含非在焦平面雜散熒光的清晰圖像，同時(shí)圖像的反差和銳利度得到了明顯改善。利用結(jié)構(gòu)照明的光學(xué)切片技術(shù)，解決了2D和3D熒光成像中獲得光學(xué)切片的非在焦平面雜散熒光的干擾、費(fèi)時(shí)的重建以及長時(shí)間的計(jì)算等問題。結(jié)構(gòu)照明技術(shù)的光學(xué)切片厚度可達(dá)0.01nm，軸向分辨率較常規(guī)熒光顯微鏡提高2倍，3D成像速度較共聚焦顯微鏡提高3倍。（2）4Pi 顯微鏡：基于干涉原理的4Pi顯微鏡是共聚焦/雙光子顯微鏡技術(shù)的擴(kuò)展。4Pi顯微鏡在標(biāo)本的前、后方各設(shè)置1個(gè)具有公共焦點(diǎn)的物鏡，通過3種方式獲得高分辨率的成像：①樣品由兩個(gè)波前產(chǎn)生的干涉光照明；②探測器探測2個(gè)發(fā)射波前產(chǎn)生的干涉光；③照明和探測波前均為干涉光。4Pi顯微鏡利用激光作為共聚焦模式中的照明光源，可以給出小于100nm的空間橫向分辨率，軸向分辨率比共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)提高4~7倍。利用4Pi顯微鏡技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1個(gè)雙光子裝置，觀測活細(xì)胞體內(nèi)的線粒體和高爾基體等細(xì)胞器的精微細(xì)節(jié)。Carl[10]首次應(yīng)用4Pi顯微鏡對哺乳動物HEK293細(xì)胞的細(xì)胞膜上Kir2.1離子通道類別進(jìn)行了測量。研究表明，4Pi顯微鏡可用于對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)納米級分辨率的形態(tài)學(xué)研究。（3）成像干涉顯微鏡(image interference microscopy, I2M)：使用2個(gè)高數(shù)值孔徑的物鏡以及光束分離器，收集相同焦平面上的熒光圖像，并使它們在CCD平面上產(chǎn)生干涉。1996年Gustaffson等用這樣的雙物鏡從兩個(gè)側(cè)面用非相干光源（如汞燈）照明樣品，發(fā)明了I3M顯微鏡技術(shù)(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并將它與I2M聯(lián)合構(gòu)成了I5M顯微鏡技術(shù)。測量過程中，通過逐層掃描共聚焦平面的樣品獲得一系列圖像，再對數(shù)據(jù)適當(dāng)去卷積，即可得到高分辨率的三維信息。I5M的分辨范圍在100nm內(nèi)。

　　2.4 非線性高分辨率顯微術(shù) 非線性現(xiàn)象可用于檢測極少量的熒光甚至是無標(biāo)記物的樣品。雖有的技術(shù)還處在物理實(shí)驗(yàn)室階段，但與現(xiàn)有的三維顯微鏡技術(shù)融合具有極大的發(fā)展空間。（1）多光子激發(fā)顯微術(shù)：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一種結(jié)合了共聚焦顯微鏡與多光子激發(fā)熒光技術(shù)的顯微術(shù)，不但能夠產(chǎn)生樣品的高分辨率三維圖像，而且基本解決了光漂白和光毒性問題。在多光子激發(fā)過程中，吸收幾率是非線性的[11]。熒光由同時(shí)吸收的兩個(gè)甚至3個(gè)光子產(chǎn)生，熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的平方成比例。對于聚焦光束產(chǎn)生的對角錐形激光分布，只有在標(biāo)本的中心多光子激發(fā)才能進(jìn)行，具有固有的三維成像能力。通過吸收有害的短波激發(fā)能量，明顯地降低對周圍細(xì)胞和組織的損害，這一特點(diǎn)使得MPEM成為厚生物樣品成像的有力手段。MPEM軸向分辨率高于共聚焦顯微鏡和3D去卷積熒光顯微鏡。（2）受激發(fā)射損耗顯微術(shù)：Westphal[12]最近實(shí)現(xiàn)了Hell等在1994年前提出的受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有關(guān)概念。STED成像利用了熒光飽和與激發(fā)態(tài)熒光受激損耗的非線性關(guān)系。STED技術(shù)通過2個(gè)脈沖激光以確保樣品中發(fā)射熒光的體積非常小。第1個(gè)激光作為激發(fā)光激發(fā)熒光分子；第2個(gè)激光照明樣品，其波長可使發(fā)光物質(zhì)的分子被激發(fā)后立即返回到基態(tài)，焦點(diǎn)光斑上那些受STED光損耗的熒光分子失去發(fā)射熒光光子的能力，而剩下的可發(fā)射熒光區(qū)被限制在小于衍射極限區(qū)域內(nèi)，于是獲得了一個(gè)小于衍射極限的光點(diǎn)。Hell等已獲得了28nm的橫向分辨率和33nm的軸向分辨率[12,13]，且完全分開相距62nm的2個(gè)同類的分子。近來將STED和4Pi顯微鏡互補(bǔ)性地結(jié)合，已獲得最低為28nm的軸向分辨率,還首次證明了免疫熒光蛋白圖像的軸向分辨率可以達(dá)到50nm[14]。（3）飽和結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)：Heintzmann等[15]提出了與STED概念相反的飽和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡的理論設(shè)想，最近由Gustafsson等[16]成功地進(jìn)行了測試。當(dāng)光強(qiáng)度增加時(shí)，這些體積會變得非常小，小于任何PSF的寬度。使用該技術(shù)，已經(jīng)達(dá)到小于50nm的分辨率。（4）二次諧波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脈沖與介質(zhì)相互作用產(chǎn)生的倍頻相干輻射作為圖像信號來源。SHG一般為非共振過程，光子在生物樣品中只發(fā)生非線性散射不被吸收，故不會產(chǎn)生伴隨的光化學(xué)過程，可減小對生物樣品的損傷。SHG成像不需要進(jìn)行染色,可避免使用染料帶來的光毒性。因其對活生物樣品無損測量或長時(shí)間動態(tài)觀察顯示出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，越來越受到生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重視[17]。

　　3 表面高分辨率顯微術(shù)

　　表面高分辨率顯微術(shù)是指一些不能用于三維測量只適用于表面二維高分辨率測量的顯微技術(shù)。主要包括近場掃描光學(xué)顯微術(shù)、全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)、表面等離子共振顯微術(shù)等。

　　3.1 近場掃描光學(xué)顯微術(shù) 近場掃描學(xué)光顯微術(shù)(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一種具有亞波長分辨率的光學(xué)顯微鏡。由于光源與樣品的間距接近到納米水平，因此分辨率由光探針口徑和探針與樣品之間的間距決定，而與光源的波長無關(guān)。NSOM的橫向分辨率小于100nm，Lewis[18]則通過控制在一定針尖振動頻率上采樣，獲得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的圖像信噪比，能夠進(jìn)行每秒100幀圖像的快速測量[19]，NSOM已經(jīng)在細(xì)胞膜上單個(gè)熒光團(tuán)成像和波譜分析中獲得應(yīng)用。

　　3.2 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù) 綠色熒光蛋白及其衍生物被發(fā)現(xiàn)后，全內(nèi)反射熒光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技術(shù)獲得了更多的重視和應(yīng)用。TIRF采用特有的樣品光學(xué)照明裝置可提供高軸向分辨率。當(dāng)樣品附著在離棱鏡很近的蓋玻片上，伴隨著全內(nèi)反射現(xiàn)象的出現(xiàn)，避免了光對生物樣品的直接照明。但因?yàn)椴▌有?yīng)，有小部分的能量仍然會穿過玻片與液體介質(zhì)的界面而照明樣品，這些光線的亮度足以在近玻片約100nm的薄層形成1個(gè)光的隱失區(qū)，并且激發(fā)這一淺層內(nèi)的熒光分子[20]。激發(fā)的熒光由物鏡獲取從而得到接近100nm的高軸向分辨率。TIRF近來與干涉照明技術(shù)結(jié)合應(yīng)用在分子馬達(dá)步態(tài)的動力學(xué)研究領(lǐng)域, 分辨率達(dá)到8nm，時(shí)間分辨率達(dá)到100μs[21]。

　　3.3 表面等離子共振 表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)入射角以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時(shí)將發(fā)生全反射，且反射光強(qiáng)度在各個(gè)角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光被耦合入表面等離子體內(nèi)可引起電子發(fā)生共振，從而導(dǎo)致反射光在一定角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱為共振角。共振角會隨金屬薄膜表面流過的液相的折射率而改變，折射率的改變又與結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。表面折射率的細(xì)微變化可以通過測量涂層表面折射光線強(qiáng)度的改變而獲得。

　　1992年Fagerstan等用于生物特異相互作用分析以來，SPR技術(shù)在DNA-DNA生物特異相互作用分析檢測、微生物細(xì)胞的監(jiān)測、蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的研究，以及細(xì)菌毒素對糖脂受體親和力和特異性的定量分析等方面已獲得應(yīng)用[23]。當(dāng)SPR信息通過納米級孔道[24]傳遞而提供一種卓越的光學(xué)性能時(shí)，將SPR技術(shù)與納米結(jié)構(gòu)設(shè)備相結(jié)合，該技術(shù)的深入研究將有可能發(fā)展出一種全新的成像原理顯微鏡。

　　【參考文獻(xiàn)】
　　[1] 湯樂民,丁 斐.生物科學(xué)圖像處理與分析[M].北京:科學(xué)出版社,2005：205.

　　[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.

　　[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.

　　[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.

　　[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.

　　[6] 李棟棟,郭學(xué)彬,瞿安連.以三維熒光反卷

跪求實(shí)驗(yàn)方案急。關(guān)于植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取的

多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是藥物開發(fā)的一個(gè)主要方向。生物體內(nèi)已知的活性多肽主要是從內(nèi)分泌腺組織器官、分泌細(xì)胞和體液中產(chǎn)生或獲得的，生命活動中的細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變、免疫調(diào)節(jié)等均與活性多肽密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，從天然產(chǎn)物中獲得肽類物質(zhì)的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應(yīng)用。不斷有新的肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質(zhì)分離、分析的主要方法研究進(jìn)展。
1 分離方法
采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質(zhì)的性質(zhì)決定。對蛋白質(zhì)、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化，同時(shí)上述這些方法也是蛋白、多肽類物質(zhì)分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現(xiàn)為肽類物質(zhì)的分離提供了有利的方法手段，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、多肽的HPLC應(yīng)用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時(shí)間內(nèi)完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規(guī)模上生產(chǎn)具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質(zhì)分離制備的最佳條件上，不少學(xué)者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內(nèi)容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結(jié)果與保留值之間的關(guān)系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結(jié)構(gòu)的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數(shù)，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質(zhì)與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數(shù)影響的關(guān)系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時(shí)間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時(shí)間，而含5～25個(gè)氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時(shí)間。同時(shí)有不少文獻(xiàn)報(bào)道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，并利用計(jì)算機(jī)處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶[一般未肽鏈內(nèi)切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結(jié)構(gòu)研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質(zhì)，通過RP-HPLC法采用C18柱檢測了重組人生長激素特征性胰肽圖譜。同時(shí)胰島素的肽圖經(jīng)V8酶專一裂解也制得，并可鑒別僅相差一個(gè)氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結(jié)構(gòu)也應(yīng)用酶解法及在線分析技術(shù)確定了肽圖，便于鑒定分析。此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在新藥開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產(chǎn)生疏水作用而達(dá)到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點(diǎn)。利用GIC分離生產(chǎn)激素（GH）產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)與活性比EP-GPLC分離的要穩(wěn)定，活性較穩(wěn)定。Geng等利用HIC柱的低變性特點(diǎn)，將大腸桿菌表達(dá)出的經(jīng)鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產(chǎn)品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經(jīng)離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達(dá)到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質(zhì)，特別對一些較大的聚集態(tài)的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結(jié)構(gòu)、構(gòu)型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強(qiáng)的特點(diǎn)。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質(zhì)的分離分析研究中，對多肽的性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強(qiáng)度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報(bào)道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構(gòu)體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價(jià)值的數(shù)據(jù)供今后此類物質(zhì)分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強(qiáng)蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達(dá)到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低于總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時(shí)Jayarama發(fā)現(xiàn)硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質(zhì)量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質(zhì)量越低，越易于與固定相結(jié)合，因此在分離相對分子質(zhì)量小的多肽時(shí)，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基于分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗(yàn)證明其在生產(chǎn)、制備過程中具有低投入、高產(chǎn)出的特性。目前市場上可供應(yīng)的PC固定相種類較多，適合于不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質(zhì)上的配基與可以和其特異性產(chǎn)生作用的配體之間的特異親和性而分離物質(zhì)的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈等等。對多肽類物質(zhì)分離目前主要應(yīng)用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據(jù)其結(jié)構(gòu)人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發(fā)展起來的一種親和方法。其固定相基質(zhì)上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側(cè)鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結(jié)構(gòu)最易結(jié)合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產(chǎn)品。
Chaiken等人報(bào)道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達(dá)產(chǎn)生，其與正鏈DNA表達(dá)產(chǎn)生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復(fù)合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復(fù)合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結(jié)合在固定相基質(zhì)上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結(jié)合可達(dá)到分離特定結(jié)構(gòu)多肽的目的。
1.3 毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統(tǒng)的電泳技術(shù)基礎(chǔ)上于本世紀(jì)60年代末由Hjerten發(fā)明的，其利用小的毛細(xì)管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術(shù)從80年代以來發(fā)展迅速，是生物化學(xué)分析工作者與生化學(xué)家分離、定性多肽與蛋白類物質(zhì)的有利工具。CE根據(jù)應(yīng)用原理不同可分為以下幾種；毛細(xì)管區(qū)帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細(xì)管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細(xì)管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質(zhì)主要是依據(jù)不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統(tǒng)凝膠電泳更準(zhǔn)確。目前存在于CZE分離分析多肽物質(zhì)的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細(xì)管硅膠柱上的硅醇發(fā)生反應(yīng)，影響峰形與電泳時(shí)間，針對這些問題不少學(xué)者做了大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，如調(diào)節(jié)電池泳液的PH值，使與硅醇反應(yīng)的極性基團(tuán)減少；改進(jìn)毛細(xì)管柱材料的組成，針對多肽性質(zhì)的不同采取不同的CZE方法研究分離5個(gè)含9個(gè)氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時(shí)分離速度快而且準(zhǔn)確。
1．3．2細(xì)管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由于不同的蛋白、多肽的等電點(diǎn)（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點(diǎn)pH條件下聚集沉淀下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質(zhì)中應(yīng)用不多，主要應(yīng)用與不同來源的多肽異構(gòu)體之間的分離，如對rHG不同異構(gòu)體分離。由于在CIEF柱表面覆蓋物的不穩(wěn)定性限制了此法的廣泛應(yīng)用。
1．3. 3毛細(xì)管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基于分子篩原理，經(jīng)十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯(lián)歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用于多肽物質(zhì)的分離分析，此電泳法適于含疏水側(cè)鏈較多的肽分離，這種凝膠易于灌注，使用壽命長，性質(zhì)較為穩(wěn)定。
1．3．4膠束電動毛細(xì)管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應(yīng)用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻(xiàn)報(bào)道在電解液中加入環(huán)糊精等物質(zhì)，可使用權(quán)含疏水結(jié)構(gòu)組分的多肽選擇性與環(huán)糊精的環(huán)孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質(zhì)分離工程的系統(tǒng)應(yīng)用
以上提到的分離多肽的技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用過程中多相互結(jié)合，根據(jù)分離多肽性質(zhì)的不同，采用不同的分離手段。特別是后基因組時(shí)代，對于蛋白質(zhì)組深入的研究，人們對于分離多肽及蛋白質(zhì)的手段不斷改進(jìn)，綜合利用了蛋白質(zhì)和多肽的各種性質(zhì)，采用包括前面提到的常規(guī)蛋白多肽提取方法，同時(shí)利用了高效液相色譜，毛細(xì)管電泳，2-D電泳等手段分離得到細(xì)胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中系統(tǒng)應(yīng)用蛋白和多肽分離鑒定的技術(shù)在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，大大的提高了蛋白多肽類物質(zhì)的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，特別是在分離純化后的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質(zhì)分析鑒定。其中連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質(zhì)譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發(fā)展起來的新方法。
2．1．1連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術(shù)，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應(yīng)用于肽類的分離檢測，其具有中等分辨率，精確度大于+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質(zhì)如甘油和高有機(jī)溶劑成分，使樣品在檢測探針處達(dá)到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結(jié)合使用達(dá)分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經(jīng)建立，并得到很好的應(yīng)用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構(gòu)相穩(wěn)定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質(zhì)譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產(chǎn)生多價(jià)離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質(zhì)量達(dá)1×105蛋白進(jìn)行分析，分辨率在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)的在線分析，且需要?dú)饣蛴袡C(jī)溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯(lián)合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯(lián)合應(yīng)用。
2.1.3 基質(zhì)輔助激光解析/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質(zhì)鑒定中精確測定測定分子質(zhì)量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量的測定，靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必備工具。同時(shí)結(jié)合液相色譜的聯(lián)用技術(shù)可以高效率的鑒定多肽物質(zhì)。特別是當(dāng)各種原理的質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，不但可以得到多肽的相對分子質(zhì)量信息，還可以測定它的序列結(jié)構(gòu)，此項(xiàng)技術(shù)將在未來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中起到?jīng)Q定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數(shù)字化、過度的重疊范圍過寬（由于相對分子質(zhì)量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質(zhì)的分析中應(yīng)用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為此類物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質(zhì)有特定的形狀而便于定量與定性分析，如何減少數(shù)據(jù)處理的時(shí)間問題等。這些問題多有不少學(xué)者在進(jìn)行研究。雖然在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用較少，NMR在分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的，可以克服上述蛋白質(zhì)分析中的缺點(diǎn)而達(dá)到快速準(zhǔn)確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質(zhì)譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法及免疫學(xué)方法等都已應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的結(jié)果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質(zhì)分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現(xiàn)，因此這一領(lǐng)域的研究具有廣闊的前景。

應(yīng)用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質(zhì)方面有著廣泛應(yīng)用，其有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺與丙烯酰胺比率的增加而減小，比率接近于1：20時(shí)，孔徑達(dá)到最小值。分子量低于10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常采取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯(lián)度，在制膠時(shí)加入一些可以降低聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)限孔徑的溶質(zhì)分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質(zhì)；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達(dá)到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配制如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調(diào)pH
** pH約為8.25
2．丙烯酰胺貯存液的配制
單丙-雙丙混合物單丙的百分?jǐn)?shù)雙丙的百分?jǐn)?shù)
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯酰胺的總濃度
C：交聯(lián)度
3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配制分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯酰胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯酰胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內(nèi)，倒入陽極緩沖液，將正負(fù)極與電泳儀相接，恒電壓50~60V，待指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓可升至70~90V，恒壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/300839.html.

聲明： 我們致力于保護(hù)作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實(shí)真實(shí)出處，未能及時(shí)與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請立即通知我們(管理員郵箱：602607956@qq.com)，情況屬實(shí)，我們會第一時(shí)間予以刪除，并同時(shí)向您表示歉意,謝謝!

上一篇: 清華大學(xué)顏寧教授Nature發(fā)表CA···

下一篇: 自噬小體與晚期內(nèi)體/溶酶體融合的分子···