JCB：CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細胞中的工作機制取得重大突破

JCB：CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細胞中的工作機制取得重大突破

2016年09月07日訊 在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院的研究人員揭示出CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細胞中的內部工作機制的重要新細節(jié)。這一發(fā)現(xiàn)可能對人們利用這種強大的基因編輯工具開發(fā)治療方法產生影響。相關研究結果發(fā)表在Journal of Cell Biology期刊上，論文標題為“CRISPR-Cas9 nuclear dynamics and target recognition in living cells”。

論文通信作者、馬薩諸塞大學醫(yī)學院細胞生物學教授和生物化學與分子藥理學教授Thoru Pederson博士說，“我們對CRISPR-Cas9復合物如何在活細胞的基因組中到處移動和發(fā)現(xiàn)靶位點的細節(jié)了解得并不多。在這項研究中，我們了解到這種復合物的工作機制對尋求為實驗室研究和潛在的診所應用開發(fā)工具的基因編輯人員而言是比較重要的和有用的?！?/p>

作為抵抗病毒入侵的細菌免疫系統(tǒng)中的一種組分，CRISPR-Cas9復合物是一種強大的基因編輯系統(tǒng)。這種CRISPR-Cas9復合物比之前的基因編輯技術更加高效和更加準確，因而科學家們在實驗室中發(fā)現(xiàn)對它進行改造和快速地運送它的方法，從而選擇性地對特異性的基因序列進行編輯。為了切割雙鏈DNA片段，CRISPR-Cas9利用由大約20個核苷酸組成的向導RNA（gRNA）靶向結合基因組中的特異性序列，在那里，Cas9隨后進行切割。這允許科學家們移除特定的基因序列或將它們插入到宿主細胞基因組中。

鑒于CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細胞內的工作機制的內在動力學性質并未得到很好地理解，一些運送系統(tǒng)和技術相比而言更容易取得成功。為了觀察CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細胞中的作用機制，Pederson博士和同事們開發(fā)出一種利用不同的熒光分子對gRNA和Cas9進行標記的技術，因此能夠同時追蹤它們。

研究人員發(fā)現(xiàn)當未結合到Cas9上時，gRNA是非常短命的。當Cas9與gRNA組裝在一起時，這種復合物更加穩(wěn)定：大約一半的復合物在細胞核中的壽命大約為15分鐘，而剩下的復合物具有更高的穩(wěn)定性。

論文共同第一作者、Pederson實驗室研究員Hanhui Ma博士說，“Cas9讓gRNA穩(wěn)定化。如果你將gRNA和Cas9各自地運送到靶細胞中，然后進行組裝，那么它將是沒有工作效率的，這是因為一些gRNA將會發(fā)生降解。如果你將它們---已經組裝在一起---同時運送到靶細胞中，那么你將觀察到更多的活性。”

研究人員還觀察到Cas9-gRNA復合物在靶位點上的停留時間決定著DNA是否將被切割。當gRNA序列與靶DNA序列完美匹配時，Cas9-gRNA復合物在離開之前，結合到這種靶DNA序列上長達兩個小時，在這期間，靶DNA序列切割也完成了。當gRNA序列與靶DNA序列存在錯配時，Cas9-gRNA復合物在靶DNA序列上的停留時間僅僅為幾分鐘的時間，因而這種切割被破壞了。

Ma說，了解到這一點后，科學家們能夠潛在地在數(shù)學上基于CRISPR-Cas9復合物在基因組位點上的停留時間長短，預測脫靶切割可能在何處發(fā)生。

Ma說，“我們仍然不知道CRISPR的規(guī)則。每個人都想知道當它被運送到活細胞中時將會發(fā)生什么。這項研究揭示了它的工作機制的一部分?！?/p>

基因編輯如何換藥不換湯

To destroy is easier than to create ，摧毀總比創(chuàng)造要簡單，這句話轉換到基因編輯上就是：knockout比knock in容易。因為knockout只要摧毀基因，而knockin則是要創(chuàng)造一個新的“基因”，這個新”基因“不僅僅正確表達，還需要有相應的功能。換言之，knockout是non-specific，而knockin則是specific。

對于干細胞、懸浮細胞、原代細胞以及靜息狀態(tài)的細胞而言，轉染已經相當困難，基于轉染方式的knockout則是難上加難，而knockin則是上下左右為難。假如你的課題需要knockin一些特殊標記，而且不止一次需要knockin一次，那么有沒有什么討巧的辦法既可以減輕工作量，又可以specific？今天我們就來講 重組酶介導的盒式交換 （recombinase-mediated cassette exchange，RMCE） ，個人關于這個技術的描述是： 換藥不換湯 。

本文的1、2點是基因重組背景知識和gateway重組的介紹， 如不需要，可直接跳到第3點，直達RMCE（寧可不看一二，也絕不能錯過三） 。

在動筆寫這篇文章RMCE之前，突然發(fā)現(xiàn)目前我們用到的幾乎所有基因編輯手段，都是一種特定生物學過程的結果，那就是-- 重組（Recombination） 。例如我們在前面的文章中有提到過 HDR（Homology directed repair）介導的CRISPR-Cas9技術，就是依賴基因的同源重組，將供體片段替換到基因組中 ；此外，在piggyBac文章中提到的基因 轉座 （Transposition ）*：DNA從某一位置移動到基因組上另一位置，也屬于基因重組的范疇，并且是一種高度特異的基因重組。因此，在我們了解RMCE之前，需要加強一遍重組在我們基因編輯技術知識譜系的重要程度。

一類：自然發(fā)生的重組類型至少有以下四種：

（1） General or homologous recombination（常規(guī)/同源重組）： 發(fā)生在序列非常相似的DNA分子之間，如二倍體生物中的同源染色體。同源重組是TELEN以及HDR介導的CRISPR-Cas9的基因編輯的基礎，由于這種方法需要供體包含有非常長的同源臂，從而可以達到精準的效果，但精準度越高，其成功率又隨之降低。

（2） Illegitimate or nonhomologous（不合理/非同源重組）： 由于這種重組方法并不需要有長同源序列，看起來“不合理”， 所以被稱之為不合理（非法）重組。這種重組可造成隨機突變，在科學研究中也有用到。

（3） Site-specific recombination（位點特異性重組）： 顧名思義，就是需要有特定的識別位點才能開啟的重組方式，而這些特定的識別位點通常長度在幾十bp左右， gateway recombination和今天我們要講的RMCE則屬于這種，由此可以想象一下RMCE也需要獨特的識別位點 。

（4） Replicative recombination： 可以看到復制性轉座屬于這種類型。

二類：人為改造/創(chuàng)造的重組類型：

（1） Plasmid Insertion Recombination（質粒插入重組）： 在體外使用核酸酶可對質粒進行酶切，使用連接酶可將質粒和DNA片段重組連接。其人為性不僅僅是因為這是體外實驗，同時人類也可以使用PCR的方式合成出相應的酶切位點，從而增加質粒的可編輯性，這對于大家來說就是家常便飯。

（2） Gene Gun Recombination（基因槍重組）： 主要用于植物工程，將包裹在金粒子上的DNA分子轟入活細胞中，最后該DNA溶液就可并入細胞的基因組中。這是一種物理改變DNA傳遞方法，同時基因傳遞的方法有以下幾個分類：

從基因槍的原理我們理解到， 改變DNA的傳遞方法，也是一種人為的重組方式 。因此上圖還將（3） Virus Replication Recombination（病毒復制重組） 和（4）電轉等等重組方式展現(xiàn)出來，這里就不再細說。

Gateway重組是常用質粒元件置換方案 ，主要用于將目的元件在不依賴于核酸酶的方式，置換到想要的backbone上。前面說到，CRISPR-Cas9是從噬菌體侵入細菌時細菌的抵抗得到啟發(fā)，而gateway重組也是一個向自然界學習的典型例子。λ噬菌體在整合因子（IFN，Int）的幫助下， 將自身的attP位點和大腸桿菌的attB位點進行位點特異性重組，從而將自身的基因組整合到大腸桿菌中，此時attB & P產生兩個新位點：attL & R 。因此人們從這上得到啟發(fā)，將att位點克隆到質粒中，這樣就可以輕松置換兩質粒的原件，從而達到“換藥不換湯”的目的。

從上圖可知：

（1）att位點的相關特性。

（2）以右圖為例，現(xiàn)想要 將左邊紫色骨架質粒的CaMPARI原件置換到右邊黃色骨架質粒上 ，由于兩個骨架質粒有可以互相重組的 attL1 & attL2位點 。將兩種質粒放在同一個反應系統(tǒng)中，使用LR clonase，即可輕松將CaMPAR從紫色骨架轉移到黃色骨架上，從而得到一個新質粒。而 ccdB是一個自殺基因 ，當細胞被轉入帶有ccdB的質粒后，大腸桿菌將不再生長，因此平板/培養(yǎng)基 只剩下含有目標質粒 的大腸桿菌。attL1 & L2重組后形成attP1 & P2的新位點。

（3）這種元件置換的方法，歸根結底就在于供體和受體之間具有可重組的識別位點，按照這樣的思路，人們可以將多種特殊的識別位點包裝為元件置換系統(tǒng)。

目的：給質粒插入RFP標簽

（1）挑選質粒

供體質粒： mRFP1Rab5 ；

目標質粒：pDONR-P2r-P3

（2）使用snapGene完成模擬

終于回到開頭，在knockin本身就很難的情況下，課題設計還需要多個knockin。如何做到只knockin一次，后面的”knockin“全部由RMCE完成。以上gateway recombination只是開胃小菜，gateway主要用于體外構建載體，而 RMCE則可在體內達成元件轉換 的作用。上一節(jié)我們了解到元件置換的基本原理就是：需要特點 識別位點+特定的重組酶 。活細胞及生物體內用到的位點特異性重組系統(tǒng)就是大名鼎鼎的 Cre-loxP、Flp-FRT以及Dre-rox 。以Cre-loxP系統(tǒng)為例:

看到上面的圖是不是感覺很混亂并不好記憶，為什么loxP方向相同是倒置，相反是敲除或者移位。很多文章會告訴上圖的內容，但根本的原因是loxP相當于影子分身，每個之間都可以互換，而且換的時候要求完全一樣（影子分身能不一樣？）。

我們想象一下上圖deletion的狀況，loxP-gene-loxP片段被Cre酶切除出來后可能出現(xiàn)的結果：

（1）左右兩個loxP由于還可以和切除位點互補重組，因此，切出來的loxP-gene-loxP片段再次被重組回去，其結果就是，切了跟沒切一樣。因此，再次印證了一句話，切開只是第一步，DNA repair才是決定結果的關鍵一步

（2）按道理左邊loxP被Cre切開后，重組時應該結合自己原來殘留的缺口，但正是因為長得一樣，它認錯了，把右邊loxp剩下的缺口給占用了，導致gene-loxP片段被擠出基因組，此時就達到了敲除的效果。

根據以上描述，我們想知道，怎樣才能解決，切了相當于沒切的問題呢？

在gateway中我們學到，att位點可有多種變體，同樣 loxP位點也是 ，如下圖所示， 不同loxP位點之間也有特定的重組方式和親和力 [2]?？梢钥吹剑?/p>

（1）野生型loxP可以和包括自己在內的所有l(wèi)oxP突變體進行重組。

（2）大部分loxP變體只能和少數(shù)loxP變體進行重組，例如：loxP66可以和loxP71、511等進行重組，最后形成相應的loxP位點。

（3）少部分loxP變體只能和自己進行重組，例如lox2272，每一種loxP變體的出現(xiàn)，都是在完善和擴大Cre-loxP系統(tǒng)，使之可使用性更強、更廣。

目的：通過元件替換方式將細胞顏色熒光標簽由綠色改為紅色

Case 1

可以看到：loxP66-GFP-loxP71元件在Cre重組酶的幫助下，被替換為loxP66-DsRed-loxP71，由此，細胞的熒光顏色由紅色轉為綠色。但這個系統(tǒng)的效果看似并不那么好，只有少數(shù)細胞表現(xiàn)為紅色，而大部分仍然是綠色的，而造成這個結果的原因是什么？歡迎留言給出自己的答案，下周我會將自己的解讀放上來。

在TELEN、ZFN和CRISPR-Cas9技術的出現(xiàn)，使得knockin所需的同源臂長度從原來的十幾kb，縮小到1 kb以內，大大降低了knockin的難度。然而即使是新技術的出現(xiàn)，knockin仍然具有較大的難度，尤其是knockin的效率會隨著插入片段的長度增加而降低，超過3kb的knockin難度大大增加。個人小小整理RMCE使用情況如下：

（1） 早期RMCE技術主要和慢病毒、轉座子系統(tǒng)結合 ：使用慢病毒或轉座子系統(tǒng)（睡美人SB或piggyBac）將master載體整合到基因組中， 構建出master cell line，之后在Cre重組酶的幫助下，將目標序列置換到master line中，從而一步得到新的細胞系。 慢病毒和轉座子系統(tǒng)有高效的特點，但其機制是隨機整合，因此當課題需要精確編輯時，這種整合方式則無法被采用。

（2）使用TELEN、ZFN技術將master載體質粒knockin到細胞中，構建master line，隨后的故事同上。這個方案運用了精準敲入，因此難度增加不少，但系統(tǒng)成熟不少。 有人可能會說，knockin我不怕難，我可以一個一個的knockin，不需要使用RMCE系統(tǒng) 。但需要考慮到同一個細胞系， 隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞系內異質性也會增加 。有些課題對基因背景的均勻性有著變態(tài)的需求，此時 使用RMCE系統(tǒng)置換元件的方式，可以得到幾乎一致的基因背景，但knockin序列不同的實驗細胞系，從而提供更均勻穩(wěn)定的實驗背景 。

（3）敲入短片段master載體，通過Cre將長片段置換到master line中，完美避開長片段敲入極其困難的困境。

（4）對于基因編輯困難的細胞，能獲取一個master line，會讓整個課題組的工具系統(tǒng)上升一個等級。做過knockin的人都知道這個過程的困難。以TELEN系統(tǒng)為例，需要共轉至少3個質粒：含有TELEN同源臂的+目的基因的載體，TELEN導航質粒Left + Right。以干細胞為例，轉染效率是1%，那么一百萬個細胞可獲得約1萬個被轉染的細胞，而被共轉的細胞則可能只有500個，這500個細胞中，真正被純合knockin的細胞可能只有幾個。按照傳統(tǒng)挑單克隆的方式，那么很有可能就是培養(yǎng)了100個單克隆細胞系，最后只有1個是真正需要的，這個工作量想起來都讓人覺得害怕。不過一般使用藥物篩選方式，可最后篩出抗藥生長的單克隆團，但分離出單克隆的步驟仍不可少。

RMCE可以提供更為均勻穩(wěn)定的實驗背景，但其優(yōu)勢也限制了其應用，因為master line敲入的位點限制了后續(xù)的應用。例如master line敲入位置是AAVS1位點，而其實課題需要的多個knockin是在多個不同位點的。此時RMCE系統(tǒng)則起不到作用。是的，RMCE是基因編輯技術的補充，不能要求其完成一切需求，但有了它，我們能用的工具就更多了。個人覺得， AAVS1 knockin的master line非常實用，可以輕松構建熒光標簽細胞系，同時更多的inducible細胞系也更容易獲取 。單獨把RMCE拿出來講，它可能不夠出彩，它只是一個默默的扳手，看起來不起眼，但在關鍵時刻，還真香。

Reference：

[1] Araki, Kimi, Masatake Araki, and Ken‐ichi Yamamura. "Site‐directed integration of the cre gene mediated by Cre recombinase using a combination of mutant lox sites." Nucleic acids research 30.19 (2002): e103-e103.

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/300121.html.

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