2016年09月10日訊 CRISPR是規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)的縮寫。CRISPR與內(nèi)切酶Cas是一對好基友,細(xì)菌依靠它們組成的防御系統(tǒng)對抗外來侵略者。CRISPR-Cas能夠在引導(dǎo)RNA的指引下,靶標(biāo)并切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點(diǎn),將CRISPR系統(tǒng)發(fā)展成了強(qiáng)大的基因組編輯工具。該系統(tǒng)使用簡單而且擴(kuò)展性強(qiáng),很快便成為了生物學(xué)領(lǐng)域最耀眼的明星。
在細(xì)菌的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中,Cas1-Cas2蛋白復(fù)合體會捕獲30-40bp的外源DNA,將它們整合到CRISPR的間隔區(qū),形成自己的免疫記憶。如果這種外源DNA再次入侵,細(xì)菌就能夠及時將其剪切,從而保護(hù)自身安全。外源DNA整合應(yīng)當(dāng)是特異性很強(qiáng)的,不然就會損害基因組或CRISPR序列。然而令人吃驚的是,這種活動在體外顯得相當(dāng)混亂。
加州大學(xué)伯克利分校的研究團(tuán)隊(duì)九月五日在Nature Structural & Molecular Biology雜志上發(fā)表文章,向人們展示了CRISPR免疫對基因組完整性的保護(hù)。這篇文章的通訊作者是著名CRISPR先驅(qū)Jennifer A. Doudna。Doudna教授是CRISPR技術(shù)的共同開發(fā)者,曾因這一技術(shù)獲得了“生命科學(xué)突破獎”(Breakthrough Prize),是CRISPR專利的有力競爭者。
研究人員發(fā)現(xiàn),釀膿鏈球菌(S. pyogenes)II-A型Cas1-Cas2整合酶通過限制整合第二步來維持特異性。在非CRISPR位點(diǎn),整合會停在位點(diǎn)中間,使反應(yīng)能夠逆轉(zhuǎn)。釀膿鏈球菌的Cas1-Cas2對旁邊的前導(dǎo)重復(fù)序列有很高的特異性,能夠識別重復(fù)序列的回文末端。這項(xiàng)研究指出,DNA插入位點(diǎn)沒有此前人們以為的那么普遍,這樣可以防止CRISPR免疫適應(yīng)的毒性,有助于維持基因組的完整性。
加州大學(xué)伯克利分校以Jennifer A Doudna為首的研究團(tuán)隊(duì)取得了諸多令人側(cè)目的CRISPR研究成果。去年四月Doudna領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在Science雜志上發(fā)表文章,為人們揭示了CRISPR-Cmr 復(fù)合體結(jié)合靶標(biāo)的具體機(jī)制。他們通過冷凍電鏡技術(shù)獲得了天然III型Cmr復(fù)合體及其與目標(biāo)RNA結(jié)合時的分子結(jié)構(gòu),獲得了接近原子水平的高分辨率。
去年十月,Doudna及其同事在Nature雜志上發(fā)表文章指出,Cas9 的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象狀態(tài)直接控制了DNA切割活性。他們通過分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn),鑒定了HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的一種激活構(gòu)象。研究還證實(shí),一個α-螺旋將HNH的構(gòu)象改變傳達(dá)給RuvC結(jié)構(gòu)域,激活它實(shí)現(xiàn)DNA切割。
今年年初,Doudna的研究團(tuán)隊(duì)揭示了CRISPR-Cas9準(zhǔn)備剪切DNA時的關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)。在CRISPR-Cas系統(tǒng)中,Cas蛋白與小CRISPR RNA(crRNA)形成復(fù)合體,切割與RNA互補(bǔ)的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一個典型特征,基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用,研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結(jié)構(gòu)。
兩種技術(shù)方法的差別還是非常大的,各有優(yōu)劣:
兩種技術(shù)方法的對比
但是Cas9有很多是只有這個技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)的:
1、對目的基因引入點(diǎn)突變;
2、敲除circRNA、LncRNA、miRNA等非轉(zhuǎn)錄的序列;
3、進(jìn)行大片段的基因敲除研究調(diào)控序列的功能;
所以這個些高級的基因研究就必須使用Cas9基因敲除技術(shù)了,而RNA干擾就望塵莫及了。
所以不同的方法在不同的應(yīng)用場景下面,都有其有點(diǎn)和局限性,孰優(yōu)孰劣取決研究者的目的。
關(guān)注Cas9X,讓更多的研究者使用Cas9X發(fā)表自己的SCI文章。
6月11日,頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》(Nature)子刊《自然-醫(yī)學(xué)》(Nature Medicine) 同時發(fā)表了兩篇新成果,給持續(xù)受到追捧的“基因魔剪” CRISPR技術(shù)潑了冷水。來自瑞典卡洛林斯卡研究所和劍橋諾華生物醫(yī)學(xué)研究院的兩個研究團(tuán)隊(duì)分別將關(guān)注點(diǎn)投到了一處:CRISPR編輯成功或增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。
兩個團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,CRISPR/Cas9基因編輯過程中造成的DNA雙鏈斷裂,會激活p53蛋白通路,引起人多能干細(xì)胞的凋亡。反過來也就是說,經(jīng)基因編輯后還能存活下來的細(xì)胞,通常存在p53功能缺陷。?
p53缺陷是至今已知的與癌癥相關(guān)的最普遍的基因突變。p53基因被稱為“抑癌基因”,其編碼的p53蛋白的重要作用之一是調(diào)控細(xì)胞分裂和增殖。正常情況下,一旦該基因察覺有嚴(yán)重DNA損傷或染色體結(jié)構(gòu)變異的“壞”細(xì)胞,p53基因會抑制細(xì)胞的分裂,并引導(dǎo)細(xì)胞自殺,因此也被冠以“基因警察”稱號。?
CRISPR技術(shù)的安全性再次受到質(zhì)疑后,首當(dāng)其沖的是幾家基因編輯領(lǐng)域內(nèi)的公司。Editas Medicine、Intellia Therapeutics、CRISPR Therapeutics這三家在紐約納斯達(dá)克上市的公司, 6月11日當(dāng)天股票均大幅下挫,跌幅分別為7.8%、9.81%和12.59%。截至6月12日,僅Intellia Therapeutics一家收住跌勢翻紅,上漲1.55%。?
增加患癌風(fēng)險(xiǎn)
此前的研究發(fā)現(xiàn),CRISPR/Cas9技術(shù)運(yùn)用到人多能干細(xì)胞(hPSC)時,效率通常低下,僅為其他細(xì)胞類型的1/5或1/10。然而,多能干細(xì)胞因其具有分化成多種成體細(xì)胞的潛能,在疾病治療時被寄予厚望。??研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,在基因編輯前后,確保p53功能正常至關(guān)重要。畢竟,如果編輯成功的前提是p53缺陷,運(yùn)用到臨床治療的后果是增加患者的患癌幾率。
CRISPR Therapeutics首席執(zhí)行官Sam Kulkarni此番也表示,該研究結(jié)果看起來是有道理的。并表示,這是我們該重視的地方,尤其是目前 CRISPR 療法被應(yīng)用于越來越多的疾病中。我們要確保這些編輯過的細(xì)胞不會在回輸體內(nèi)后成為癌細(xì)胞。
來源:澎湃新聞網(wǎng)
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