2016年09月12日訊 CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學(xué)領(lǐng)域近十年最熱門的兩大技術(shù)?,F(xiàn)在,科學(xué)家們正在撮合它們聯(lián)姻。人們普遍認(rèn)為,iPS與CRISPR的結(jié)合會(huì)起到一加一大于二的效果。舉例來(lái)說(shuō),CRISPR用于人類iPSC可以揭示基因在特定疾病中所起的作用,甚至可以校正患者細(xì)胞的基因缺陷。雖然CRISPR-Cas9和人類iPSC在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)相當(dāng)普及了,但二者相結(jié)合并沒(méi)有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個(gè)工具的專家聯(lián)系,推出了在人類干細(xì)胞中使用CRISPR的基礎(chǔ)指南。這份指南對(duì)人iPSC和人胚胎干細(xì)胞同樣適用。
敲除VS精確編輯
當(dāng)你用CRISPR-Cas9切割基因的時(shí)候,主要有兩個(gè)分子通路在執(zhí)行DNA修復(fù)。這兩個(gè)同時(shí)發(fā)生的通路決定了基因編輯的精確性。非同源末端連接(NHEJ)負(fù)責(zé)敲除基因,制造破壞基因功能的小插入/缺失。同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)根據(jù)供體DNA精確改變核苷酸序列。
不少研究者在進(jìn)行基因組編輯的時(shí)候使用偏向HDR的條件。他們發(fā)現(xiàn),人多能干細(xì)胞的編輯效果比傳統(tǒng)永生細(xì)胞系差,轉(zhuǎn)染100個(gè)iPSC只能引入一個(gè)正確的改變。這是CRISPR基因組編輯面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn),不過(guò)Hockemeyer覺(jué)得自己的團(tuán)隊(duì)還能應(yīng)付?!叭绻阌泻芎玫亟M織培養(yǎng)流程,那么挑200個(gè)克隆就能獲得2個(gè)正確克隆。一個(gè)學(xué)生在三小時(shí)內(nèi)就能搞定,”他介紹道。
Hockemeyer及其同事正在開(kāi)發(fā)新策略,試圖讓天平向HDR傾斜,比如采用特殊化合物或者其他物種的Cas9?!拔艺J(rèn)為這個(gè)問(wèn)題很可能未來(lái)幾年內(nèi)就能得到解決,”Hockemeyer表示。
Conklin團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種快速數(shù)字PCR測(cè)試,用來(lái)定量HDR和NHEJ的修復(fù)效率。他們的研究顯示,在人iPSC和其他一些細(xì)胞中,HDR和NHEJ效率之間并沒(méi)有什么關(guān)系。
驗(yàn)證你的基因組編輯
如何證明CRISPR系統(tǒng)完成了正確的切割呢?你可以給細(xì)胞提供與編輯基因互補(bǔ)的DNA,這些DNA應(yīng)該能夠挽救相應(yīng)的細(xì)胞表型。如果細(xì)胞表型變化很小難以觀察,你可以嘗試再次編輯這個(gè)基因,看看能否使其恢復(fù)成野生型,Hocke?meyer說(shuō)。
研究者們也會(huì)抽查自己的基因組,比如對(duì)編輯區(qū)域進(jìn)行PCR和Sanger測(cè)序。免費(fèi)算法TIDE可以在PCR和Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上鑒定目標(biāo)突變及其發(fā)生的頻率。
外顯子組測(cè)序?qū)⒊蔀轵?yàn)證基因組編輯的首選方法。“測(cè)序可能是對(duì)你整個(gè)系統(tǒng)最完全的分析。如果這個(gè)細(xì)胞系要用上十年,那么測(cè)序就是你應(yīng)該做的投資。你需要確保一切都盡善盡美,”Mali指出。同時(shí)我們也應(yīng)當(dāng)請(qǐng)牢記,遺傳學(xué)差異會(huì)隨著時(shí)間的推移慢慢累積,任何細(xì)胞系都不例外。
脫靶效應(yīng)并非大問(wèn)題
針對(duì)同一個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)以上有充分差異的向?qū)NA,這是防止脫靶編輯一個(gè)主要途徑??偟膩?lái)說(shuō),脫靶效應(yīng)對(duì)于絕大多數(shù)基礎(chǔ)研究者來(lái)說(shuō)并不是什么特別大的問(wèn)題,Cowan認(rèn)為。CRISPR系統(tǒng)在人多能干細(xì)胞中的脫靶效應(yīng)比癌細(xì)胞系少得多,Cheng也表示。但如果真的很擔(dān)心脫靶,全外顯子測(cè)序?qū)⑹悄阕詈玫倪x擇。
用CRISPR調(diào)控基因表達(dá)
如果你指望在多能干細(xì)胞中敲除多能性必需基因,那你肯定要失望了。因?yàn)榍贸@些基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在這種情況下,我們只能選擇下調(diào)(或上調(diào))基因的表達(dá)水平。研究者們?yōu)榇舜蛟炝耸ゴ呋钚缘膁Cas9,dCas9能到達(dá)向?qū)NA指定的位點(diǎn),但無(wú)力對(duì)DNA進(jìn)行剪切。用dCas9抑制轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRi,用dCas9激活轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRa。
今年三月Cell Stem Cell雜志發(fā)表的一項(xiàng)研究顯示,對(duì)iPSC進(jìn)行功能缺失篩選的時(shí)候,CRISPRi比傳統(tǒng)CRISPR更為有效。CRISPRi在95%的細(xì)胞中沉默目的基因,CRISPR-Cas9只能在60-70%的細(xì)胞中關(guān)閉目的基因,而且CRISPRi沒(méi)有發(fā)生脫靶。
基因表達(dá)控制和基因編輯之前的主要區(qū)別在于,基因表達(dá)控制并非永久性改變基因組。你可以干擾細(xì)胞沉默基因,然后再逆轉(zhuǎn)這種抑制。此外,與CRISPR-Cas9相比,CRISPRi和CRISPRa的脫靶效應(yīng)更小。
CRISPR調(diào)控基因表達(dá)也存在一定的挑戰(zhàn)。舉例來(lái)說(shuō),設(shè)計(jì)一組可靠的向?qū)NA很難,Mali說(shuō)。在理想情況下,向?qū)NA應(yīng)當(dāng)避開(kāi)緊緊纏繞核小體的基因組區(qū)域。但有時(shí)候我們想要靶標(biāo)的位點(diǎn)就在這些區(qū)域里。
將CRISPRa和CRISPRi送入人多能干細(xì)胞也比較復(fù)雜?!笆笴RISPRa和CRISPRi進(jìn)入70-80%的細(xì)胞依然很難,除非你使用病毒來(lái)遞送。通常我們說(shuō)的都是30-40%的細(xì)胞,”Cowen指出,他正在用CRISPRa激活和驗(yàn)證報(bào)告基因。這種方法對(duì)他很有幫助,因?yàn)閕PSC很難分化成他想要的腎內(nèi)皮細(xì)胞。
我們基因組的80%會(huì)轉(zhuǎn)錄成RNA,但這些轉(zhuǎn)錄本大多不生成蛋白質(zhì)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA往往與人類疾病有關(guān),不過(guò)絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPRa和CRISPRi特別適合分析非編碼RNA的具體功能。前不久,The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的開(kāi)發(fā)者和使用者共同編寫(xiě)了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南,幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。
在CRISPR系統(tǒng)的基礎(chǔ)上使用sgRNA文庫(kù)進(jìn)行遺傳篩選,是鑒定基因調(diào)控子的一種有效方法。研究者們可以通過(guò)CRISPR篩選在基因組非編碼區(qū)域中尋找功能性元件。不過(guò)這樣的應(yīng)用需要高度覆蓋又簡(jiǎn)單實(shí)用的自定義sgRNA文庫(kù)。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為Molecular Chipper的新技術(shù)。該技術(shù)能夠針對(duì)指定基因組區(qū)域生成密集覆蓋的sgRNA文庫(kù)。
本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/299324.html.
聲明: 我們致力于保護(hù)作者版權(quán),注重分享,被刊用文章因無(wú)法核實(shí)真實(shí)出處,未能及時(shí)與作者取得聯(lián)系,或有版權(quán)異議的,請(qǐng)聯(lián)系管理員,我們會(huì)立即處理,本站部分文字與圖片資源來(lái)自于網(wǎng)絡(luò),轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來(lái)源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益,請(qǐng)立即通知我們(管理員郵箱:602607956@qq.com),情況屬實(shí),我們會(huì)第一時(shí)間予以刪除,并同時(shí)向您表示歉意,謝謝!
上一篇: 為何每周四天工作制不利于我們的健康?