專家經(jīng)驗(yàn)談之如何用CRISPR編輯iPS細(xì)胞

2016年09月12日訊 CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學(xué)領(lǐng)域近十年最熱門的兩大技術(shù)?，F(xiàn)在，科學(xué)家們正在撮合它們聯(lián)姻。人們普遍認(rèn)為，iPS與CRISPR的結(jié)合會(huì)起到一加一大于二的效果。舉例來(lái)說(shuō)，CRISPR用于人類iPSC可以揭示基因在特定疾病中所起的作用，甚至可以校正患者細(xì)胞的基因缺陷。雖然CRISPR-Cas9和人類iPSC在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)相當(dāng)普及了，但二者相結(jié)合并沒(méi)有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個(gè)工具的專家聯(lián)系，推出了在人類干細(xì)胞中使用CRISPR的基礎(chǔ)指南。這份指南對(duì)人iPSC和人胚胎干細(xì)胞同樣適用。

敲除VS精確編輯

當(dāng)你用CRISPR-Cas9切割基因的時(shí)候，主要有兩個(gè)分子通路在執(zhí)行DNA修復(fù)。這兩個(gè)同時(shí)發(fā)生的通路決定了基因編輯的精確性。非同源末端連接（NHEJ）負(fù)責(zé)敲除基因，制造破壞基因功能的小插入/缺失。同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）根據(jù)供體DNA精確改變核苷酸序列。

不少研究者在進(jìn)行基因組編輯的時(shí)候使用偏向HDR的條件。他們發(fā)現(xiàn)，人多能干細(xì)胞的編輯效果比傳統(tǒng)永生細(xì)胞系差，轉(zhuǎn)染100個(gè)iPSC只能引入一個(gè)正確的改變。這是CRISPR基因組編輯面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)，不過(guò)Hockemeyer覺(jué)得自己的團(tuán)隊(duì)還能應(yīng)付?！叭绻阌泻芎玫亟M織培養(yǎng)流程，那么挑200個(gè)克隆就能獲得2個(gè)正確克隆。一個(gè)學(xué)生在三小時(shí)內(nèi)就能搞定，”他介紹道。

Hockemeyer及其同事正在開(kāi)發(fā)新策略，試圖讓天平向HDR傾斜，比如采用特殊化合物或者其他物種的Cas9?！拔艺J(rèn)為這個(gè)問(wèn)題很可能未來(lái)幾年內(nèi)就能得到解決，”Hockemeyer表示。

Conklin團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種快速數(shù)字PCR測(cè)試，用來(lái)定量HDR和NHEJ的修復(fù)效率。他們的研究顯示，在人iPSC和其他一些細(xì)胞中，HDR和NHEJ效率之間并沒(méi)有什么關(guān)系。

驗(yàn)證你的基因組編輯

如何證明CRISPR系統(tǒng)完成了正確的切割呢？你可以給細(xì)胞提供與編輯基因互補(bǔ)的DNA，這些DNA應(yīng)該能夠挽救相應(yīng)的細(xì)胞表型。如果細(xì)胞表型變化很小難以觀察，你可以嘗試再次編輯這個(gè)基因，看看能否使其恢復(fù)成野生型，Hocke?meyer說(shuō)。

研究者們也會(huì)抽查自己的基因組，比如對(duì)編輯區(qū)域進(jìn)行PCR和Sanger測(cè)序。免費(fèi)算法TIDE可以在PCR和Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上鑒定目標(biāo)突變及其發(fā)生的頻率。

外顯子組測(cè)序?qū)⒊蔀轵?yàn)證基因組編輯的首選方法。“測(cè)序可能是對(duì)你整個(gè)系統(tǒng)最完全的分析。如果這個(gè)細(xì)胞系要用上十年，那么測(cè)序就是你應(yīng)該做的投資。你需要確保一切都盡善盡美，”Mali指出。同時(shí)我們也應(yīng)當(dāng)請(qǐng)牢記，遺傳學(xué)差異會(huì)隨著時(shí)間的推移慢慢累積，任何細(xì)胞系都不例外。

脫靶效應(yīng)并非大問(wèn)題

針對(duì)同一個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)以上有充分差異的向?qū)NA，這是防止脫靶編輯一個(gè)主要途徑?？偟膩?lái)說(shuō)，脫靶效應(yīng)對(duì)于絕大多數(shù)基礎(chǔ)研究者來(lái)說(shuō)并不是什么特別大的問(wèn)題，Cowan認(rèn)為。CRISPR系統(tǒng)在人多能干細(xì)胞中的脫靶效應(yīng)比癌細(xì)胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很擔(dān)心脫靶，全外顯子測(cè)序?qū)⑹悄阕詈玫倪x擇。

用CRISPR調(diào)控基因表達(dá)

如果你指望在多能干細(xì)胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因?yàn)榍贸@些基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在這種情況下，我們只能選擇下調(diào)（或上調(diào)）基因的表達(dá)水平。研究者們?yōu)榇舜蛟炝耸ゴ呋钚缘膁Cas9，dCas9能到達(dá)向?qū)NA指定的位點(diǎn)，但無(wú)力對(duì)DNA進(jìn)行剪切。用dCas9抑制轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRi，用dCas9激活轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRa。

今年三月Cell Stem Cell雜志發(fā)表的一項(xiàng)研究顯示，對(duì)iPSC進(jìn)行功能缺失篩選的時(shí)候，CRISPRi比傳統(tǒng)CRISPR更為有效。CRISPRi在95%的細(xì)胞中沉默目的基因，CRISPR-Cas9只能在60-70%的細(xì)胞中關(guān)閉目的基因，而且CRISPRi沒(méi)有發(fā)生脫靶。

基因表達(dá)控制和基因編輯之前的主要區(qū)別在于，基因表達(dá)控制并非永久性改變基因組。你可以干擾細(xì)胞沉默基因，然后再逆轉(zhuǎn)這種抑制。此外，與CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脫靶效應(yīng)更小。

CRISPR調(diào)控基因表達(dá)也存在一定的挑戰(zhàn)。舉例來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)一組可靠的向?qū)NA很難，Mali說(shuō)。在理想情況下，向?qū)NA應(yīng)當(dāng)避開(kāi)緊緊纏繞核小體的基因組區(qū)域。但有時(shí)候我們想要靶標(biāo)的位點(diǎn)就在這些區(qū)域里。

將CRISPRa和CRISPRi送入人多能干細(xì)胞也比較復(fù)雜?！笆笴RISPRa和CRISPRi進(jìn)入70-80%的細(xì)胞依然很難，除非你使用病毒來(lái)遞送。通常我們說(shuō)的都是30-40%的細(xì)胞，”Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和驗(yàn)證報(bào)告基因。這種方法對(duì)他很有幫助，因?yàn)閕PSC很難分化成他想要的腎內(nèi)皮細(xì)胞。

我們基因組的80%會(huì)轉(zhuǎn)錄成RNA，但這些轉(zhuǎn)錄本大多不生成蛋白質(zhì)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA往往與人類疾病有關(guān)，不過(guò)絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPRa和CRISPRi特別適合分析非編碼RNA的具體功能。前不久，The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的開(kāi)發(fā)者和使用者共同編寫(xiě)了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

在CRISPR系統(tǒng)的基礎(chǔ)上使用sgRNA文庫(kù)進(jìn)行遺傳篩選，是鑒定基因調(diào)控子的一種有效方法。研究者們可以通過(guò)CRISPR篩選在基因組非編碼區(qū)域中尋找功能性元件。不過(guò)這樣的應(yīng)用需要高度覆蓋又簡(jiǎn)單實(shí)用的自定義sgRNA文庫(kù)。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為Molecular Chipper的新技術(shù)。該技術(shù)能夠針對(duì)指定基因組區(qū)域生成密集覆蓋的sgRNA文庫(kù)。

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