2016年09月26日訊 加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)家Jennifer A. Doudna教授是基因組編輯技術(shù)變革的先驅(qū)之一,她曾因這一技術(shù)獲得了“生命科學(xué)突破獎(jiǎng)”( Breakthrough Prize),同時(shí)也是CRISPR專利的有力競(jìng)爭(zhēng)者。Doudna帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)取得了諸多令人側(cè)目的CRISPR研究成果,僅在2016年9月份,她帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)就先后在國(guó)際權(quán)威期刊《Molecular Cell》、《Nature Structural Biology》、《Nature Biotechnology》、《Nature Communications》和《Nature》發(fā)表五項(xiàng)重磅研究成果。
細(xì)菌利用CRISPR RNA(crRNAs)指導(dǎo)的監(jiān)視復(fù)合體,來靶定要破壞的外源核酸。雖然大多數(shù)I型和III型CRISPR系統(tǒng)需要四個(gè)或更多的不同蛋白質(zhì),才能形成多亞基的監(jiān)視復(fù)合體,但是,I-C型系統(tǒng)只使用三個(gè)蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)crRNA成熟和雙鏈DNA的靶標(biāo)識(shí)別。2016年9月1日,Cell子刊《Molecular Cell》在線發(fā)表的一項(xiàng)研究中,Doudna教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)表明,上述每個(gè)蛋白質(zhì)都發(fā)揮著多重的功能和結(jié)構(gòu)作用:Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向?qū)?,以用于?jīng)由Cas8c的DNA結(jié)合和解旋。研究人員采用冷凍電子顯微鏡技術(shù),獲得了Cascade/I-C 監(jiān)視復(fù)合體的自由形式和DNA結(jié)合形式的重建結(jié)構(gòu),所揭示的構(gòu)象變化可使得形成R環(huán),每一條DNA鏈都有不同的定位。這種精簡(jiǎn)的I-C型系統(tǒng)解釋了CRISPR通路如何可能進(jìn)化出結(jié)構(gòu)緊湊,保留其作為RNA引導(dǎo)性DNA捕獲平臺(tái)的全部功能。
在細(xì)菌的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中,Cas1-Cas2蛋白復(fù)合體可捕獲30-40bp的外源DNA,將它們整合到CRISPR的間隔區(qū),并形成自己的免疫記憶。如果這種外源DNA再次入侵,細(xì)菌就能夠及時(shí)將其剪切,從而保護(hù)自身安全。外源DNA整合應(yīng)當(dāng)是特異性很強(qiáng)的,不然就會(huì)損害基因組或CRISPR序列。然而令人吃驚的是,這種活動(dòng)在體外顯得相當(dāng)混亂。Doudna教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)于2016年9月5日在《Nature Structural & Molecular Biology》雜志上發(fā)表文章,向人們展示了CRISPR免疫對(duì)基因組完整性的保護(hù)。
9月8日,Doudna教授和北卡羅來州立大學(xué)的Rodolphe Barrangou共同撰寫的題為“Applications of CRISPR technologies in research and beyond”的綜述文章,發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上。這篇綜述文章指出,用CRISPR-Cas9的可編程DNA裂解,使得科學(xué)家能夠在單細(xì)胞和整個(gè)生物體中進(jìn)行有效的、位點(diǎn)特異性的基因組工程。CRISPR基因組編輯已經(jīng)被用于各種途徑,例如控制轉(zhuǎn)錄、改變表觀基因組、進(jìn)行全基因組篩選和染色體成像。CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)被用于緩解動(dòng)物的遺傳性疾病,并可能很快用于臨床治療人類眼部和血液疾病。在中國(guó)和美國(guó)已有批準(zhǔn)兩項(xiàng)研究,將CRISPR-Cas9用于癌癥靶向治療。除了這些生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用之外,這些工具也被用于加快農(nóng)作物和畜牧育種,設(shè)計(jì)新的抗生素,控制攜帶疾病的昆蟲。這項(xiàng)綜述回顧了CRISPR-Cas9技術(shù)當(dāng)前和未來的應(yīng)用,包括治療、異種器官移植和在畜牧、農(nóng)作物、食品生物以及工業(yè)微生物的用途。該文章還討論了這種變革性技術(shù)的科學(xué)、商業(yè)、監(jiān)管和倫理影響。
9月14日,Doudna教授和伊利諾伊大學(xué)香檳分校的Taekjip Ha教授,以共同通訊作者身份在《Nature Communications》上發(fā)表題為“Real-time observation of DNA recognition and rejection by the RNA-guided endonuclease Cas9”的研究成果。這項(xiàng)研究指出,Cas9引導(dǎo)性RNA復(fù)合物與DNA的結(jié)合特異性,對(duì)于基因組工程應(yīng)用是非常重要的,然而,不匹配如何影響靶識(shí)別/排斥反應(yīng)動(dòng)力學(xué),仍沒有得以很好的理解。該研究小組使用單分子FRET,來探討Cas9-RNA和DNA靶標(biāo)之間的實(shí)時(shí)互動(dòng)。研究人員對(duì)Cas9-RNA的結(jié)合和解離動(dòng)力學(xué),進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查分析,作為序列不匹配的一個(gè)功能,來迅速確定同源序列是如何被迅速識(shí)別的,以及部分匹配的序列是如何被迅速排斥的。
近期,Doudna教授為首的研究團(tuán)隊(duì),又?jǐn)U大了新發(fā)現(xiàn)的CRISPR蛋白C2c2的作用,該蛋白靶定RNA而非DNA。C2c2一直被稱為RNA引導(dǎo)性RNA切酶;然而,對(duì)于這種蛋白質(zhì)是如何切割RNA的,還缺乏一個(gè)全面的了解。9月26日在《Nature》發(fā)表的一篇題為“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”的論文中,研究人員證明,C2C2并不像以前認(rèn)為的只有一種、而是有兩種不同的RNA切割活性,它們一起可以被用于強(qiáng)大的RNA檢測(cè)與降解。
Doudna說“這項(xiàng)研究擴(kuò)展了我們對(duì)C2c2指導(dǎo)RNA加工的理解,并提供了這種新型RNase的第一種應(yīng)用。C2c2實(shí)質(zhì)上是一位自我武裝的哨兵,在檢測(cè)到其靶標(biāo)后可攻擊所有RNA。這種活性可以被用作一個(gè)自動(dòng)放大檢測(cè)器,作為一種低成本的診斷法可能是有用的?!?/p>
這兩種不同的RNA切割活性,每種都有其各自的功能。第一種負(fù)責(zé)生產(chǎn)使C2c2找到特定靶RNA分子的引導(dǎo)性RNA。第二種可一次激活一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的互補(bǔ)RNA靶標(biāo),作為一個(gè)普通的RNA切割器,可破壞所有存在的RNA。
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