CCR：抗體/小分子組合治療展現(xiàn)對抗成神經(jīng)細胞瘤的新希望

CCR：抗體/小分子組合治療展現(xiàn)對抗成神經(jīng)細胞瘤的新希望

2016年10月11日訊 最近來自美國洛杉磯兒童醫(yī)院薩班研究所的研究人員進行了一項研究，進一步揭示了細胞因子TGFβ1在成神經(jīng)細胞瘤生長中的作用，并且提示了小分子藥物/抗體組合療法治療這種癌癥的可能性。相關研究結果發(fā)表在國際學術期刊Clinical Cancer Research上。

成神經(jīng)細胞瘤是一種發(fā)生在神經(jīng)組織的實體瘤，也是最常見的一種兒童癌癥類型，大約一半發(fā)病兒童不到兩歲，占全部兒童癌癥死亡的15%。使用一種叫做dinutuximab的抗體藥物靶向成神經(jīng)細胞瘤表面高表達的GD2分子是目前治療這種疾病的一種治療方法。但是這種基于抗體開發(fā)的治療方法仍不足以防止癌癥復發(fā)。

除了直接靶向參與疾病發(fā)生的分子，許多抗體療法還靶向激活自然殺傷細胞（NK細胞）。NK細胞是一類受到抗體激活以后能夠殺傷腫瘤細胞的免疫細胞。最近發(fā)現(xiàn)類似TGFβ1這樣的蛋白分子能夠抑制腫瘤微環(huán)境中NK細胞的抗癌功能。

TGFβ1是一種執(zhí)行許多種細胞功能的分泌蛋白，其功能包括控制細胞生長、增殖和細胞死亡。在這項研究中，研究人員找到一個對抗成神經(jīng)細胞瘤的新組合治療方法，其中既包括抗體藥物dinutuximab，又包含一種叫做galunisertib的小分子藥物，這種藥物能夠抑制TGFβ1的作用。研究人員將成神經(jīng)細胞瘤細胞系或病人來源的成神經(jīng)細胞瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)在對其進行組合治療，發(fā)現(xiàn)galunisertib介導對TGFβ1的抑制，讓dinutuximab和NK細胞能夠更加有效地殺傷成神經(jīng)細胞瘤。

"將galunisertib這種藥物加入到基于NK細胞的細胞療法中能夠抑制腫瘤生長，促進移植了腫瘤組織的小鼠模型的存活。"洛杉磯兒童醫(yī)院薩班研究所的獨立研究員Robert Seeger這樣說道。他表示galunisertib能夠逆轉TGFβ1誘導的對細胞殺傷作用的抑制，或可提高基于抗體的免疫治療方法對成神經(jīng)細胞瘤的治療效果。

肝癌的免疫治療是怎樣的？

肝癌的形成和發(fā)展過程中，可以通過干擾和抑制機體免疫功能逃避免疫系統(tǒng)殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者淋巴細胞亞群，CD4陽性細胞降低，陽性細胞增高，導致下降，NK細胞、LAK細胞的活性亦明顯下降，外周血T細胞亞群及NK活性呈明顯抑制狀態(tài)，患者經(jīng)過繼免疫治療后，T細胞亞群及NK細胞活性明顯改善。

臨床類型不同的肝癌，TIL浸潤程度亦不同，無TIL浸潤的患者，術后生存時間較TIL浸潤的短，肝癌復發(fā)率也明顯增高。在肝癌患者血清和肝癌細胞培養(yǎng)上清液可發(fā)現(xiàn)一些能抑制機體免疫功能的物質(zhì)。

通過調(diào)節(jié)和增強機體免疫力，達到對肝癌細胞抑制或殺傷效果的治療方法，稱為免疫治療。臨床常用凍干卡介苗、轉移因子、免疫核糖核酸、干擾素、阿地白介素（白細胞介素2）、腫瘤壞死因子等。

近年應用IL-2/LAK和IL-2/TIL等過繼免疫療法治療肝癌，取得了一定的療效。采用合并化療免疫或過繼免疫化療，以及單克隆抗體為載體的導向治療，呈現(xiàn)了良好的趨勢。但確切的療效尚未肯定，有待進一步研究。

可分為主動、被動和過繼免疫。根據(jù)特異性，又可以分為特異性和非特異性免疫。

（1）主動免疫治療：①特異性主動免疫治療：特異性主動免疫是將腫瘤細胞抗原加入完全或不完全佐劑，制成疫苗，對機體進行主動免疫，以提高機體對腫瘤的免疫力。Hanna等采用豚鼠荷瘤模型進行特異性主動免疫治療發(fā)現(xiàn)，將靜脈注射106肝癌細胞的豚鼠作為治療組，90天以后，對照組動物全部死亡，而治療組動物存活率為66.7%，同時觀察到本方法與化療能起協(xié)同殺傷作用。目前，特異性主動免疫治療的方法有：制備腫瘤多肽疫苗和基因工程疫苗：

根據(jù)腫瘤相關抗原的結構，制備出相對特異的疫苗，使機體產(chǎn)生特異性免疫效應。

抗獨特型抗體疫苗：抗腫瘤抗體高變區(qū)存在獨特型抗原，而抗特異抗原的抗體高變區(qū)與腫瘤抗原結構相似，從而可以模擬腫瘤疫苗觸發(fā)機體的抗腫瘤反應。

但是，主動特異性免疫尚存在某些缺陷，近年來，已經(jīng)加強某些相關的治療研究，如加強肝癌細胞MHC-I、B7等基因的表達，使得免疫細胞能更有效地識別和清除腫瘤抗原，達到更好的治療效果。

②主動非特異性免疫治療：采用非特異性免疫制劑，增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，激活效應細胞，提高機體非特異性免疫能力，以發(fā)揮抗腫瘤效應的治療叫主動非特異性免疫治療。目前常用的免疫刺激劑和調(diào)節(jié)劑有四類：微生物及其制劑：凍干卡介苗、短小棒狀桿菌、鏈球菌及病毒等。生物制劑：如干擾素、腫瘤壞死因子、胸腺素等。

化學制劑如左旋咪唑等。

以下介紹幾種常用藥物。

①凍干卡介苗：凍干卡介苗能非特異性地激活巨噬細胞和T淋巴細胞、K細胞、NK細胞，這可能是其抗肝癌的主要作用機制。臨床試驗表明凍干卡介苗對肝癌具有一定的療效。單純應用凍干卡介苗治療143例Ⅱ期肝癌患者，一年生存率為25.8%，而對照組僅為13.4%。凍干卡介苗與腫瘤疫苗聯(lián)合使用，療效更好。

如接種凍干卡介苗后，皮膚潰瘍數(shù)月才愈合，說明機體防御能力良好，如對疫苗無反應，則提示預后不良。凍干卡介苗一般用量為6×108個活菌，通常采用皮內(nèi)接種、皮上劃痕、口服和瘤內(nèi)注射、腹腔注射等給藥途徑。毒副反應主要有局部皮膚紅腫、潰爛，發(fā)熱、肌肉酸痛、畏寒等感冒癥狀群，體溫一般不超過39℃。

②短小棒狀桿菌：短小棒狀桿菌能刺激單核細胞和巨噬細胞，提高機體非特異性免疫功能。短小棒狀桿菌結合化學治療，使晚期腫瘤患者生存期較單純化療對照組延長2倍。用短小棒狀桿菌加順鉑腔內(nèi)灌注治療肝癌腹水患者，有效率遠高于單用順鉑的對照組。

短小棒狀桿菌臨床常用劑量為4mg/次，1次/周。注射途徑有瘤內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈和腹腔等。

③鏈球菌制劑（OK432）：OK432是從溶血型鏈球菌中開發(fā)出來的一種生物調(diào)節(jié)劑，它可以刺激淋巴細胞對腫瘤組織的反應，具體機制尚不太清楚。將OK432局部注射于腫瘤組織，能使腫瘤縮小，AFP水平下降。將OK432與肝癌的其他治療方法如手術切除、動脈栓塞、化療等聯(lián)合使用，可以起到協(xié)同殺傷肝癌細胞的作用，患者生存期明顯延長。

④干擾素（IFN）：最初發(fā)現(xiàn)，人體在接觸病毒后會產(chǎn)生一種干擾病毒生長和增殖的蛋白質(zhì)，稱之為干擾素，后來發(fā)現(xiàn)，干擾素對許多惡性腫瘤細胞的增殖具有抑制作用。目前認為干擾素的抗腫瘤機制為抑制腫瘤病毒的繁殖及癌細胞中癌基因的過表達，調(diào)節(jié)宿主的免疫活性，如激活單核.巨噬細胞、NK細胞活性，介導細胞毒效應，促使內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生，促進腫瘤相關抗原、MHC-I類抗原的表達，提高效應細胞對腫瘤細胞的識別能力。

根據(jù)抗原特異性和分子結構的不同，將干擾素分為α、β、γ三種。

由白細胞（主要為淋巴細胞）生成的主要為IFN-α，由成纖維細胞生成的主要為IFN-β，由植物血凝素刺激正常淋巴細胞或經(jīng)抗原致敏淋巴細胞接觸同種抗原后生成的主要為IFN-γ，現(xiàn)已可以通過生物工程技術，生產(chǎn)出生物學作用相同，活性更強的各種干擾素。

IFN已大量應用于腫瘤的臨床治療，對血液系統(tǒng)腫瘤的療效良好，單獨應用實體瘤治療僅對腎癌、惡性黑色素瘤療效較可靠。但應用IFN與化療等聯(lián)合應用治療肝癌，癌腫縮小程度和患者生存時間均高于對照組。比較三種干擾素的抗肝癌作用發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的抗腫瘤作用比IFN-α、IFN-β療效強。

IFN目前常用的給藥途徑為肌內(nèi)注射，一般劑量為次，1次/d或隔日1次。常見的副反應有發(fā)熱、畏寒、肌肉酸痛等流感樣癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)輕度骨髓抑制現(xiàn)象。副反應在用藥初期往往較明顯，以后逐漸減輕，停藥后癥狀消失。

⑤腫瘤壞死因子（TNF）：TNF是單核巨噬細胞受內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的一種非糖基化蛋白，由巨噬細胞產(chǎn)生的為TNF-α，由淋巴細胞產(chǎn)生的稱TNF-β，由NK細胞生成的稱為TNF-γ。其抗癌機制為：

能特異性、選擇性抑制腫瘤細胞DNA合成；通過腫瘤細胞表面受體介導內(nèi)化，進入溶酶體，發(fā)揮細胞毒作用；損傷或阻塞腫瘤血管，引起腫瘤組織出血性或缺血性壞死；增強免疫功能，活化淋巴細胞，激活NK細胞；可促進IFN-γ的生成；通過增強腫瘤血管內(nèi)皮細胞MHC-I型抗原的表達，提高前凝血素的產(chǎn)生和降低血栓調(diào)節(jié)素的生成，促進血管內(nèi)皮細胞轉變?yōu)楸砻娲倌?，引起腫瘤血管內(nèi)血流凝固，介導腫瘤組織細胞的壞死。

將TNF與化療藥物氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑（DDP）、多柔比星（ADM）或絲裂霉素（MMC）混合，加用碘化油和吸收性明膠海綿為栓塞劑治療中晚期肝癌，腫瘤縮小率、手術切除率及生存期均較單純化療栓塞組高。有研究將表達TNF的真核表達系統(tǒng)導入肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)其體外的致瘤性較對照組明顯減弱。

TNF可用于肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈滴注、動脈灌注和腔內(nèi)注射，由于其半衰期短，必須連續(xù)大劑量用藥方能奏效。目前臨床應用TNP治療肝癌的經(jīng)驗尚不多，給藥方法、劑量有待進一步完善。常見的副作用有寒戰(zhàn)、高熱、乏力、肌痛、惡心、嘔吐，一過性ALT和肌酐升高，血小板和白細胞減少，嚴重者可出現(xiàn)毛細血管滲漏綜合征。

（6）阿地白介素（白細胞介素-2）：IL-2是由抗原活化輔助性T細胞分泌的一種細胞因子，主要誘導效應細胞的增殖和活化，增強細胞毒或溶細胞活性。阿地白介素（IL-2）可以誘導細胞毒性T細胞、NK細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、CD3單抗激活的殺傷細胞（CD3AK）等效應細胞，增強對腫瘤細胞的殺傷效應。

（2）被動性免疫治療：被動性免疫治療是應用肝癌相關抗原的抗體，通過抗體介導的細胞毒作用達到殺滅肝癌細胞的作用。目前極少單獨應用抗體對肝癌進行被動免疫治療，多采用抗體為彈頭的導向治療，詳見導向治療。

（3）過繼性免疫治療：①特異性過繼性免疫治療：應用特異性抗原致敏的淋巴細胞及其因子，如轉移因子、免疫核糖核酸對腫瘤的治療，稱之為特異性過繼免疫治療。

轉移因子是一種小分子核酸肽，有免疫特異性，無抗原性，主要作用有：特異性轉移細胞免疫反應?！翱乖蕾嚒毙栽鰪娏馨图毎姆磻浴７翘禺愋源碳ぷ饔?，提高細胞免疫功能，促進單核細胞吞噬功能，誘導干擾素生成。

轉移因子配合化療和中藥治療肝癌，能提高機體免疫功能，減輕臨床癥狀，使腫塊縮小，AFP水平下降，轉移因子通常用于皮下注射，毒副作用較少見。

②非特異性過繼性免疫治療：應用非特異性免疫因子/免疫效應細胞對惡性腫瘤進行治療的方法，叫非特異性過繼性免疫療法（AIT）。

AIT自20世紀80年代以來，已進行了大量的基礎和臨床應用研究，它不受宿主免疫狀態(tài)的影響，也不引起免疫耐受，目前研究最多的是淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）、腫瘤浸潤淋巴細胞及白細胞介素-2。

LAK細胞：將來自患者或異體的淋巴細胞，體外培養(yǎng)經(jīng)IL-2誘導，轉變成非特異性殺傷淋巴細胞，然后回輸患者體內(nèi)，利用被誘導激活的淋巴細胞，發(fā)揮對肝癌細胞的殺傷效應。LAK細胞的前體細胞可能是具有細胞毒活性作用的異質(zhì)細胞群體，不受MHC-Ⅰ型抗原的限制，也不受腫瘤抑制因子的影響，具有廣譜的抗腫瘤作用，因此，對逃避NK細胞“捕獲”的腫瘤細胞也有廣泛的殺傷作用。

最初LAK細胞是取自腫瘤患者外周血淋巴細胞，由于血液來源有限，使LAK細胞的應用受到一定程度的限制。繼之研究發(fā)現(xiàn)，來自同種異體的淋巴細胞，如取自臍帶血的淋巴細胞，經(jīng)IL-2誘導活化后同樣具有相同的生物學功能，從而為LAK細胞拓寬了來源。人們曾嘗試能否應用大劑量阿地白介素（IL-2）在體內(nèi)對淋巴細胞進行活化而達到LAK細胞的治療效果，實踐證明尚存較大的距離，可能的原因是阿地白介素（IL-2）半衰期短，不能維持足夠的高濃度，而過大劑量的阿地白介素（IL-2）對機體的毒副作用大，難以耐受，從而使體內(nèi)環(huán)境不利于LAK細胞的激活和擴增。

目前傾向于經(jīng)肝動脈途徑給藥，這樣可以增加局部有效細胞數(shù)量，減少LAK細胞用量，減輕毒副反應。有癌性胸腹水者可經(jīng)胸、腹腔內(nèi)給藥。阿地白介素（IL-2）與LAK細胞可以同時輸注，亦可經(jīng)外周靜脈維持滴注。一般治療的LAK細胞數(shù)量應達到次，8～10次為1個療程，阿地白介素（IL-2）用量為（1～3）×105U。

LAK/IL-2的毒副作用主要為畏寒、發(fā)熱、皮疹等。

腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）：分離肝癌組織或癌周淋巴結中的淋巴細胞，經(jīng)體外IL-2誘導活化和擴增，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，對肝癌細胞產(chǎn)生殺傷作用，即為TIL療法。與LAK細胞比較，TIL的細胞來源不同，TIL的前體細胞絕大部分是細胞毒T淋巴細胞，能表達T細胞抗原，多數(shù)CD4、CD8陽性。TIL細胞經(jīng)IL-2誘導后，擴增能力強于LAK細胞，容易獲得所需要的效應細胞數(shù)。由于TIL細胞接受自體腫瘤抗原的持續(xù)性刺激，特異性高，殺傷活性比LAK細胞強50～100倍，因僅對自體來源的腫瘤細胞具有識別和殺傷作用。

TIL細胞輸入體內(nèi)后迅速分布在肺臟中，24h后聚集于肝、脾，48～72h在癌灶中達高峰，可維持5～9天。

由于TIL主要是利用患者瘤內(nèi)或癌旁淋巴結的前體細胞，所以臨床應用受到一定的限制。

免疫學技術知識總結 第二章

第二章 抗體制備技術

抗體的基本概念：多克隆抗體（多個淋巴細胞克隆所分泌的抗體）和單克隆抗體（單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體）

單克隆抗體的特點：

高度均質(zhì)（同一亞類），化學組成均一，不含或很少含Ig

特異性強，只針對某一種抗原表位

親和力強

抗原用量少，無須純化

無批間差異

來源穩(wěn)定，可達批生產(chǎn)，容易標準化

不易形成沉淀線

操作比較麻煩

什么條件下需要制備單抗：

目的蛋白有類似的結構

抗原不純，無法分開

多抗的效果不好（已經(jīng)排除非特異性反應）

希望將抗體用于治療，研制成藥物

希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑。

第一節(jié)?? 多克隆抗體的之別

一、多克隆抗體制備的原理

抗體制備、動物免疫、抗體純化

二、多抗的基本條件

1.? ?免疫原的制備

顆粒性抗原：細胞、病毒、細菌等，一般具有較強的免疫原性，可以不加佐劑，直接進行腹腔注射。

可溶性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核細胞或者真核細胞中表達，可溶性抗原需要與弗氏佐劑完全或不完全混勻，才可以進行免疫。

（1） 完全抗原的提取：細胞破碎法、抗原提取、抗原的純化

（2）半抗原與載體的交聯(lián)：載體的選擇、半抗原與載體偶聯(lián)的方法、偶聯(lián)復合物的鑒定

（3）合成肽抗原：免疫原性肽的選擇、肽的合成和純化

2. 免疫動物的選擇：

3.? ?佐劑的準備：

佐劑的種類：無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑、油劑

三、多克隆抗體制備的基本方法

1.? 抗原計量、免疫途徑與免疫日程

免疫動物的方法：

免疫原值被：

無佐劑免疫法：適用于顆粒性抗原

弗氏佐劑免疫法：適用于可溶性抗原

鋁佐劑免疫法：適用于人的免疫

免疫動物（一般選擇雌性動物，溫順并且可以生產(chǎn)）

皮內(nèi)免疫法

皮下或肌肉免疫法

淋巴結免疫法

混合法

抗體效價滿意后靜脈注射加強免疫

常見的注射方法；皮下注射、皮內(nèi)注射、尾靜脈注射、靜脈注射

2.? ?小樣試血與采血

抗血清的獲得：眼眶取血、頸動脈放血、心臟采血

免疫效果評價：取血（兔耳動脈、鼠尾靜脈）、檢測（雙向免疫擴散、ELISA）

3.? ?抗體的分離和純化技術

鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析、親和層析法、電泳分離法

親和層析法原理：利用蛋白質(zhì)之間的特異性結合（抗原-抗體、受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結合，捕捉與他相配的物質(zhì)，洗脫另外一種物質(zhì)，并且洗脫一般用改變pH的方法。

主要步驟：將蛋白質(zhì)與活化柱子結合，將腹水或者血清處理后過柱子，用結合緩沖液洗柱子（知道A280為零），永安氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液，測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品。

4.? ?抗體的鑒定

蛋白質(zhì)濃度的測定：紫外分光比色法、雙縮脲法、福林酚法、

免疫效果評價：雙向免疫擴散、ELISA

純度分析：免疫印跡（WB）

抗體類別分析：免疫金試條

親和力分析：ELISA、熒光偏振

5.? 抗體的保存

抗體的濃縮：吸收、蒸發(fā)、超濾

抗體的保存：濃縮抗議+甘油+防腐劑

免疫效果不佳的原因可能是：抗原純度不夠、免疫原性低、免疫途徑乳化不合格、免疫劑量不合適、動物疾病或者種屬差異小。

第二節(jié)? 單克隆抗體制備技術

一、單克隆抗體制備的原理

1個B細胞只能產(chǎn)生1個抗體。方法是細胞工程雜交技術和B細胞雜交瘤技術

需要將單克隆B細胞和腫瘤細胞相結合才可以永久產(chǎn)生單抗

Barski等發(fā)現(xiàn)細胞額自然融合現(xiàn)象，但是頻率很低

岡田等發(fā)現(xiàn)滅火的仙臺稟賦和聚乙二醇能顯著提高細胞融合的效率。

二、單抗制備的基本條件

需要培養(yǎng)正常的B細胞以及B細胞融合的腫瘤細胞

1.? ?動物的免疫抗原與載體、動物的選擇、免疫途徑

舉例：小鼠免疫

第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑——小鼠背部皮下注射（4周后）

第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑——小鼠背部皮下注射（3周后）

第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（10天后檢測血清效價）

加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（3天后）

細胞融合

2.? 酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養(yǎng)

細胞DNA合成途徑：

次黃嘌呤（H）通過嘌呤合成跑路途經(jīng)合成HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）進一步合成鳥嘌呤核苷酸

胸腺嘧啶核苷（T）通過嘧啶合成旁路途經(jīng)合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），進一步合成胸腺嘧啶脫氧核苷酸

氨基酸、谷氨酰胺、鳥核苷單磷酸通過核酸生物合成主要途徑結合上面兩步合成的鳥嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脫氧核苷酸形成DNA

將第三步當中氨基端變?yōu)榘被剩ˋ），則無法形成DNA。

因此酶缺陷型細胞的篩選就是HAT篩選

3.? ?單抗檢測方法的建立

免疫酶技術

免疫熒光技術

免疫擴散技術

三、單抗制備的基本方法

1.? ?酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養(yǎng)

組織培養(yǎng)的基本條件：

儀器：包括CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺、液氮罐、低速低溫離心機

試劑：培養(yǎng)液、HAT選擇培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、血清、抗生素

耗材：培養(yǎng)板、培養(yǎng)品、吸管、移液管

骨髓瘤細胞系的選擇要點：

（1）? 所選的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物品系相同

（2）? 自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈和輕鏈

（3）? 對氨基碟呤敏感

（4）? 與免疫脾細胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌的Ig雜交細胞

2.? ?飼養(yǎng)細胞的制備

飼養(yǎng)細胞的作用：

（1） 增加細胞濃度，滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的要求

（2）? 吞噬清楚死亡的細胞

（3）? 分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長

飼養(yǎng)細胞的種類和制備方法

（1）? 小鼠腹腔巨噬細胞

（2）? 小鼠脾細胞

（3）? 成纖維細胞

3.? ? ?脾細胞的分離

（1）? 拉頸椎處死小鼠

（2）? 無菌操作取出脾臟

（3）? 清洗、研磨

（4）? 收集細胞

（5）? 離心洗滌

（6）? 細胞計數(shù)

4.? ? ?細胞融合：骨髓瘤細胞和脾細胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融劑PEG

細胞融合的方法：PEG融合、仙臺病毒、電融合

5.? ? HAT選擇性培養(yǎng)

?????? HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細胞的DNA生物合成右主要途徑和補償途徑。當A存在是，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，須通過補償途徑合成DNA，這時就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。

?????? 由于選用西黃嘌呤鳥嘌呤荷塘轉移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在細胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）細胞作為親本，該校只能通過群全條件的DNA培養(yǎng)基才可合成，因此雜種細胞通過互補作用獲得HGPPT或者TK基因。只有雜種細胞可以活，酶缺乏性細胞完全無法存活，單克隆B細胞一般不能長期生長，就起到了分離雜交細胞的作用。

?????? 細胞生長情況：融合3-4天之后，可以看到刑訴骨髓瘤細胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。

?????? 篩選后存活的細胞就是脾細胞和骨髓瘤細胞融合細胞。

6.? ? ?陽性克隆的篩選

分泌單克隆抗體雜交瘤細胞的檢測方法

免疫酶技術：簡介ELISA法

免疫熒光技術：間接免疫熒光測定法、流式細胞分析技術（陰性對照：骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清，陽性對照：免疫鼠血清）

7.? ? ?克隆化培養(yǎng)：陽性細胞的單克隆化

克隆是指由單個細胞繁殖、擴增而形成的性狀均一的細胞集落的過程。

常見方法有：有限稀釋法和軟瓊脂克隆技術

有限稀釋法：從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞。

軟瓊脂克隆技術：從陽性分泌孔中收集雜交瘤細胞，一適當濃度雜交瘤細胞加入到軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成有一個細胞增殖來的細胞集群。

單克隆抗體的鑒定：

（1）? 抗體敏感性檢測：對腹水和培養(yǎng)基上清進行效價測定

（2）? 抗體特異性鑒定：是否與其他抗原右交互反應。

（3） 抗體效價測定

（4）? 抗體亞類鑒定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM

（5）? 抗體親和力鑒定

（6）? 識別表位分析

8.? ? 單克隆抗體的擴大生產(chǎn)：細胞培養(yǎng)法、小鼠體內(nèi)誘生法、生物反應器

細胞培養(yǎng)法：雜交瘤細胞、培養(yǎng)瓶或罐中培養(yǎng)、收集上清液、純化抗體

動物體內(nèi)誘生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液體是啦或降植烷、腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞、收集腹水

生物反應器：發(fā)酵罐培養(yǎng)

單抗培養(yǎng)常見的問題：

（1）? 污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作

（2）? 融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基

（3）? 抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、培養(yǎng)體系有問題

（4）? 雜交瘤細胞難以克隆化：血清質(zhì)量、細胞活性

第三節(jié)? 基因工程抗體制備技術

基因工程抗體：通過基因工程的手段，按照個人意愿進行細胞人工改造的技術。

優(yōu)點主要有：特異性高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉、工藝簡單、異源性滴低、穿透性好、功能豐富。

一、鼠源抗體人源化

鼠源抗體應用中的障礙：免疫原性、半衰期短、抗體功能片段失活。

1.? ? ?嵌合抗體：可變區(qū)基因克隆、表達載體的構建、嵌合抗體的表達

2.? ? ?改型抗體

二、小分子抗體：Fab抗體、Fv抗體和單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位

小分子抗體的優(yōu)點：

（1）可在原核體系中表達，降低生產(chǎn)成本。

（2）因為其分子量小，穿透能力強，易進入病灶部位，有利于對腫瘤等疾病的治療。

（3）不含F(xiàn)c片段，不與Fc受體結合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響。

（4）在體內(nèi)半衰期短，有利于體內(nèi)毒性物質(zhì)的消除

（5）易于進一步基因工程分改造。

三、]基于抗體的應用

1.? ? ?CAR-T免疫治療：

?????? CAR-T免疫療法：即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是一種新型的過繼性細胞療法，即利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞的細胞療法，并非藥物。

?????? CAR-T技術：通過整個嵌合抗原受體的經(jīng)過基因修飾的T細胞抵抗腫瘤細胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關抗原或者腫瘤特異性抗原，識別結合后將激活及增值信號傳遞到T細胞內(nèi)，引起T細胞激活，增殖釋放細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞。

2. 免疫檢查點

3.? 免疫毒素

4.? ADC

5.? 雙特異性抗體

第四節(jié)??[endif]抗體庫技術

抗體庫技術：即用基因克隆技術將全套抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達載體上，通過原核系統(tǒng)直接表達有功能的抗體分子片段，并篩選出特異性的抗體分子和可變區(qū)基因。

一、噬菌體展示技術原理：噬菌體展示技術是將外源蛋白質(zhì)或者DNA序列查到噬菌體外殼上的適當位置，使外源基因隨著外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨著噬菌體的重新組裝而展現(xiàn)倒是菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已經(jīng)靠發(fā)出單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)等。

二、噬菌體抗體制備的基本程序

1.? ? ?收集淋巴細胞提取mRNA并轉錄到cDNA或直接提取斯堡基因組的DNA

2.? ? ?擴增DNA的抗體可變區(qū)基因

3.???? [構建重組噬菌體庫

4.? ? ?篩選所需特征的重組噬菌體

5.? ? ?采用突變或鏈置換使親和力成熟

三、噬菌體抗體技術的特點

1.? ? ?篩選步驟簡單、快速、有效

2.? ? ?擴大了篩選流量，一次就可以篩選多于1010個的克隆

3.? ? ?抗體基因型與表現(xiàn)性聯(lián)系密切，基因穩(wěn)定且容易改造

4.? ? 模擬天然免疫系統(tǒng)親和力成熟過程

5.? ? ?無需人工接種

6.? ? ?可替代動物多克隆抗體

7.? ? ?構建康體苦時。輕重鏈可變區(qū)基因在體外隨機組合，可產(chǎn)生體內(nèi)部存在的輕重鏈組合，得到新的特異性抗體。

8.? ? ?可以在預案和系統(tǒng)中表達，大規(guī)模生產(chǎn)方便，且成本低。

四、抗體庫技術的應用

1.? ? ?制備全人源抗體

2.? ? ?改良基因工程抗體

腫瘤免疫治療的單克隆抗體類免疫檢查點抑制

1. Anti-CTLA-4單抗
細胞毒性T淋巴細胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4）又名CD152，是由CTLA-4基因編碼的一種跨膜蛋白，表達于活化的CD4和CD8 T細胞。CTLA-4和CD28均為免疫球蛋白超家族成員，具有高度同源性，二者與相同的配體B7-2（CD86）和B7-1（CD80）結合。與CD28功能相反，CTLA-4與其配體B7分子結合后后產(chǎn)生抑制性信號，抑制T細胞激活，是免疫系統(tǒng)一個至關重要的 “剎車”。CTLA-4是使腫瘤細胞免受T細胞攻擊的一個重要機制。因此阻斷CTLA-4的免疫效應可刺激免疫細胞活化，大量增殖，從而誘導或增強抗腫瘤免疫反應。
目前兩種靶向CTLA-4的抗體Ipilimumab和Tremelimumab在黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、肺癌等的臨床研究已廣發(fā)開展。1/2期臨床研究結果顯示兩種抗體無論是抗體單藥還是聯(lián)合IL-2，gp100疫苗或化療均顯示安全有效。
Ipilimumab是全人源化單抗，已被美國FDA批準用于晚期黑色素瘤。在肺癌治療中的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗也迅速開展。Tremelimumab也是一種人源化CTLA-4單抗，是一種IgG2抗體，目前在多種腫瘤中的臨床試驗正在進行中。
2. Anti-PD-1/PD-L1單抗
程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）為CD28超家族成員。 PD-1表達于活化的T細胞，B細胞及髓系細胞，其有兩個配體，即程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1, PD-L1）和PD-L2。PD-L1/L2在抗原遞呈細胞都表達，PD-L1在多種組織也有表達。PD-1與PD-L1的結合介導T細胞活化的共抑制信號，調(diào)節(jié)T細胞活化和增殖，起到類似于CTLA-4的負調(diào)節(jié)作用。華裔科學家陳列平實驗室首先發(fā)現(xiàn)PD-L1在腫瘤組織高表達，而且調(diào)節(jié)腫瘤浸潤CD8 T細胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調(diào)節(jié)對抗腫瘤有重要的意義。
近年來，已有多種Anti-PD-1/PD-L1抗體在腫瘤免疫治療的臨床研究迅速開展。目前Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批準用于晚期黑色素瘤，最近Nivolumab也已被美國FDA批準用于晚期鱗狀非小細胞肺癌的治療。另外，MPDL3280A （anti-PD-L1單抗），Avelumab（anti-PD-L1單抗）等也已進入多個晚期臨床研究中，覆蓋非小細胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多個瘤種。
3. 其它類型單克隆抗體
其它如增強T細胞第二信號從而促進腫瘤特異性T細胞活化和增值的單抗類，如腫瘤壞死因子TNF受體家族的OX40和4-1BB單抗也在研發(fā)中。

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/294607.html.

聲明： 我們致力于保護作者版權，注重分享，被刊用文章因無法核實真實出處，未能及時與作者取得聯(lián)系，或有版權異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡，轉載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標注錯誤或侵犯了您的合法權益，請立即通知我們(管理員郵箱：602607956@qq.com)，情況屬實，我們會第一時間予以刪除，并同時向您表示歉意,謝謝!

上一篇: 生長遲緩與中晚期早產(chǎn)兒神經(jīng)心理問題有···

下一篇: Nature：為什么睡覺前我們會覺得···