科學(xué)家為細(xì)菌重編基因組密碼,提高抗病毒能力(CRISPR簡述)

最近，美國耶魯大學(xué)和哈佛大學(xué)的科學(xué)家合作，為一種細(xì)菌重新編寫了完整的基因組編碼，并提高了其抗病毒能力。

“這是第一次從根本上改變了遺傳密碼?！闭撐墓餐呒壸髡摺⒁敶髮W(xué)分子、細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)副教授法倫艾薩克斯說，“創(chuàng)造一個有著新基因編碼的生物，這讓我們能利用許多強有力的方法來擴展生物功能的范圍?！?/p>

蛋白質(zhì)是由dna指令所編碼，并由20種氨基酸所構(gòu)成，在細(xì)胞中執(zhí)行多種重要的功能作用。氨基酸由4個核苷酸組合成的整套64個三聯(lián)體編碼，這4個核苷酸包含了dna的主體部分。這些三聯(lián)體（包含3個核苷酸的單元）叫做密碼子，就是生命的基因字母表。

本研究由艾薩克斯和論文合著者、哈佛醫(yī)學(xué)院的喬治?切爾奇共同負(fù)責(zé)。研究中，他們改變了生物學(xué)的基本規(guī)則，探索能否替換自然生物的某些密碼子或整個基因組字母，然后再引入全新字母創(chuàng)造出自然界沒有的氨基酸。

實驗中，研究人員替換了大腸桿菌的一個密碼子，刪除了其本身固有的停止標(biāo)記，該停止標(biāo)記可終止蛋白質(zhì)合成。他們將“停止”密碼子進(jìn)行了修改，使之編碼了一種新型氨基酸，并以“即插”方式插入到基因組中。新基因組能限制病毒用來感染細(xì)胞的一種天然蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，從而讓細(xì)菌擁有了抵抗病毒感染的能力。

創(chuàng)造一種基因組重編碼的生物，使其造出強大的新型蛋白質(zhì)用于各種目的：從對抗疾病到制造新材料，提高了研究人員改造自然的能力。本研究標(biāo)志著人們首次能改變一個生物整個基因組的全部基因編碼。

艾薩克斯說，本研究為把重編碼細(xì)菌變成“活制造廠”搭建了廣闊舞臺，以生物制造方式創(chuàng)造出新型“特異”蛋白質(zhì)和高分子聚合物，而這些新型分子為新一代材料設(shè)計、納米結(jié)構(gòu)、治療方法及藥物遞送工具奠定了基礎(chǔ)?！坝捎诨蚓幋a是通用，本研究也為重新編程其他生物的基因組帶來了光明前景，并對生物技術(shù)行業(yè)帶來巨大的影響，有可能開辟出全新的研究與應(yīng)用之路?！?/p>

總編輯圈點

包括人在內(nèi)的各種生物主導(dǎo)著世界。而讓生物千差萬別，世界豐富多彩的，正是基因。科學(xué)家進(jìn)行基因研究、破譯基因組密碼的最終目的，就是為了有朝一日能夠自如地改寫、甚至編排這個世界上最神奇和復(fù)雜的密碼。如今美國科學(xué)家在這一領(lǐng)域占得先機，第一次從根本上改變了遺傳密碼?？梢哉f，這是人類有能力對生物遺傳密碼重新改寫的重要證明。如果有一天真正擁有了“上帝之手”，對人類和世界而言到底是喜是憂？而這雙“手”又是否真的無所不能？這一切真讓人既憧憬又緊張。

CRISPR簡述

（1）鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)：是第一代人工核酸內(nèi)切酶

（2）類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)：第二代人工核酸酶。

（3）Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 第三代人工核酸內(nèi)切酶（前兩代就是ZFN和TAILEN）。
（4）人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)

Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)研究，而張峰和George Church在各種人類細(xì)胞中的應(yīng)用方面貢獻(xiàn)較多，其中張鋒對CRISPR/Cas9技術(shù)方面的改進(jìn)也有突出的貢獻(xiàn)。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR） ：是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的有規(guī)律成簇又帶間隔的短回文序列，可以幫助細(xì)菌抵抗噬菌體的入侵，是細(xì)菌針對噬菌體的獲得性免疫。 CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng) 。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。

CRISPR locus是由幾個原件構(gòu)成，如下圖：一開始是個反向轉(zhuǎn)錄的RNA，是特異的非編碼RNA，可以和重復(fù)序列部分互補（trancrRNA，橙色矩形），后面是各種cas基因（箭頭表示），接著是CRISPR排列（棕色的菱形是重復(fù)序列，彩色的是間隔）。而這些間隔序列是細(xì)菌從噬菌體DNA中獲得的遺傳序列：當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌，細(xì)菌激活相關(guān)的cas基因——Cas1，Cas2,和Csn2，將其中新的間隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦獲得新的間隔序列以后，新的spacer就會出現(xiàn)在pre-crRNA中，此時tracrRNA與不同的SPACER互補，在RNaseIII的作用下，產(chǎn)生crRNA，進(jìn)一步在其他未知的核酸酶的作用，剪切crRNA的5'端， 使得引導(dǎo)序列長為20nt 。如果噬菌體注入DNA，那么這個免疫系統(tǒng)將被激活，來干擾剪切噬菌體DNA，起到獲得性免疫作用。

經(jīng)過廣譜檢測，人們發(fā)現(xiàn)了三種主要的CRISPR系統(tǒng)，它們由CRISPR-associated (Cas)基因、非編碼rna和一組獨特的重復(fù)元素(直接重復(fù))組成，而這些重復(fù)序列則由來自外源性DNA靶點(即原間隔體)的短可變序列直接間隔開來；重復(fù)序列+間隔序列=CRISPR RNA (crRNA) array。在有DNA靶點的情況下，每一個間隔序列都有一個前間區(qū)序列鄰近基序（PAM——Ⅱ型系統(tǒng)的PAM基序為 5-NGG-3 ）。

II型CRISPR系統(tǒng)是最具特征的系統(tǒng)之一，它由核酸酶Cas9、編碼引導(dǎo)rna的crRNA陣列和有助于將crRNA陣列加工成離散單元的所需輔助反式激活crRNA (tracrRNA)組成

S. pyogenes亞型II-A Cas9(1368個氨基酸)是基因組工程中研究最多、使用最多的Cas9版本。其優(yōu)勢是：氨基酸序列相對較小，方便操作，且只是需要一個DNA內(nèi)切酶Cas9來對與sgRNA20個互補堿基的帶有PAM結(jié)構(gòu)的DNA進(jìn)行剪切。剪切后是DNA產(chǎn)生平末端的DSB（雙鏈斷裂），然后在進(jìn)行非同源的末端連接(NHEJ)過程中，容易隨機插入或者刪除或者替換。或者進(jìn)行高保真的同源定向修復(fù)(HDR)，修復(fù)DNA。

CRISPR RNA (crRNA) array，編碼gRNA，再加上tracrRNA，則可達(dá)到定位+編輯的功能 ，gRNA用于引導(dǎo)，tracrRNA用于結(jié)合靶點。把crRNA和tracrRNA合在一起，成為了single-guide RNA，即 sgRNA ，而通過修改tracrRNA的序列，在理論上可以on-target任何目的靶點。

這項技術(shù)主要由sgRNA定位到一個基因位點上，由Cas9酶在該位點進(jìn)行DNA雙鏈的切割，切割導(dǎo)致DNA修復(fù)通路的激活，使得其它的堿基加入進(jìn)切割的位點，造成frameshift突變，使得基因無法被表達(dá)成功能性蛋白。

Cas9造成基因不被表達(dá)是由NHEJ修復(fù)通路引起，然而，Cas9造成的DSB并不一定會引發(fā)NHEJ，因為DSB end的堿基并沒有任何損壞，這種end也叫blunt end，很容易再次粘連在一起，此時可以通過外源性同源重組引入Gene drive，或者說blunt end再次粘連在一起，sgRNA也會會再次識別這段序列，然后Cas9會再次切，反復(fù)下去，直到發(fā)生了由NHEJ引導(dǎo)出的突變，sgRNA才不會識別這段序列。

CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成 。

①前導(dǎo)序列 ：富含AT堿基，位于CRISPR基因上游， 被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動子 。

②重復(fù)序列 ：長度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)， 穩(wěn)定RNA的整體二級結(jié)構(gòu) 。

③間隔序列 ： 是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列 。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會予以精確打擊。

化膿性鏈球菌 Cas9（以下稱為SpyCas9）是大型（1,368個氨基酸）多結(jié)構(gòu)域和多功能DNA核酸內(nèi)切酶。它通過其兩個不同的核酸酶結(jié)構(gòu)域在PAM上游剪接dsDNA 3 bp：一個HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域，其切割與指導(dǎo)RNA序列互補的DNA鏈（靶鏈），以及一個RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域，其負(fù)責(zé)切割DNA。與互補鏈相反的鏈（非目標(biāo)鏈）。除了在CRISPR干擾中起關(guān)鍵作用外，Cas9還參與crRNA成熟和間隔區(qū)獲取。

先簡單介紹一下張鋒實驗室的CRISPR DOUBLE NICKASE

和普通Cas9不同的是，Cas9n (Cas9 Nickase)上有一個D10A的氨基酸突變，這個突變使得Cas9不再導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和NHEJ修復(fù)（一種會引來突變的修復(fù)），而是會引起單鏈斷裂和BER修復(fù)（一種不會引起突變的修復(fù)），如下圖

利用Cas9 nickase只能進(jìn)行單鏈剪切的特性，張峰團隊想到把兩個Cas9 nickase共同作用在一個基因位點上，使其形成雙鏈斷裂（DSB），而非特異性結(jié)合則不會引起DSB，這樣就降低了非特異性突變。

Cas9可以對靶基因組進(jìn)行剪切，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下，細(xì)胞會采用高效的 非同源末端連接 方式（NHEJ）對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。但是，在修復(fù)過程中通常會發(fā)生堿基插入或缺失的錯配現(xiàn)象，造成移碼突變，（ 移碼突變 ：是指DNA分子由于某位點堿基的缺失或插入，引起閱讀框架變化，造成下游的一系列密碼改變，使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。）使靶標(biāo)基因失去功能，從而實現(xiàn)基因敲除。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性，可將Cas9的一個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，形成只能對DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計兩條sgRNA序列，分別靶向DNA互補的兩條鏈，這樣兩條sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列，即可形成DNA斷裂，并在修復(fù)過程中通過移碼突變實現(xiàn)基因敲除

當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中，基因組斷裂部分會依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行 同源重組修復(fù) （HDR），從而實現(xiàn)基因敲入。修復(fù)模板由需要導(dǎo)入的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成，同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低，通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時期，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行；或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ，提高HDR的效率

Cas9的特點是能夠自主結(jié)合和切割目的基因，通過點突變的方式使Cas9的兩個結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始，從而抑制基因表達(dá)；將dCas9結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會對基因組DNA造成永久性的改變。

將多個sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時對多個基因進(jìn)行編輯，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下，一個質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。

利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的?；蚪M篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù)，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應(yīng)以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP-Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢，在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因，如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。

重生細(xì)胞愿望變異在哪

1 重生細(xì)胞愿望變異的位置在基因組的某個地方。

2 在我們體內(nèi)的細(xì)胞中，基因組指的是細(xì)胞核內(nèi)所有染色體的DNA分子的總和。
這些DNA分子包含了我們所有的基因，而基因又決定了我們身體的各種特征。
當(dāng)某個基因突變或發(fā)生變異時，就會影響到一些特定的生理功能。
重生細(xì)胞愿望變異也是一種基因突變，可能是由于某些因素導(dǎo)致基因發(fā)生了變異，使得細(xì)胞的再生和修復(fù)能力發(fā)生了變化。

3 目前，重生細(xì)胞愿望變異的具體位置和機制還需要進(jìn)一步的研究和探索。
但是，可以肯定的是，如果我們能夠掌握這種變異的機制和方法，就有可能利用它來治療許多難以治愈的疾病，這對于人類健康事業(yè)將是一個巨大的進(jìn)步。

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/139510.html.

聲明： 我們致力于保護(hù)作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實真實出處，未能及時與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請立即通知我們(管理員郵箱：602607956@qq.com)，情況屬實，我們會第一時間予以刪除，并同時向您表示歉意,謝謝!

上一篇: 美國發(fā)現(xiàn)新型肉毒桿菌,擔(dān)心引爆生物戰(zhàn)···

下一篇: 研究發(fā)現(xiàn)維生素不能隨意補充,過度攝入···