最近,美國耶魯大學(xué)和哈佛大學(xué)的科學(xué)家合作,為一種細(xì)菌重新編寫了完整的基因組編碼,并提高了其抗病毒能力。
“這是第一次從根本上改變了遺傳密碼?!闭撐墓餐呒壸髡摺⒁敶髮W(xué)分子、細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)副教授法倫艾薩克斯說,“創(chuàng)造一個有著新基因編碼的生物,這讓我們能利用許多強有力的方法來擴展生物功能的范圍?!?/p>
蛋白質(zhì)是由dna指令所編碼,并由20種氨基酸所構(gòu)成,在細(xì)胞中執(zhí)行多種重要的功能作用。氨基酸由4個核苷酸組合成的整套64個三聯(lián)體編碼,這4個核苷酸包含了dna的主體部分。這些三聯(lián)體(包含3個核苷酸的單元)叫做密碼子,就是生命的基因字母表。
本研究由艾薩克斯和論文合著者、哈佛醫(yī)學(xué)院的喬治?切爾奇共同負(fù)責(zé)。研究中,他們改變了生物學(xué)的基本規(guī)則,探索能否替換自然生物的某些密碼子或整個基因組字母,然后再引入全新字母創(chuàng)造出自然界沒有的氨基酸。
實驗中,研究人員替換了大腸桿菌的一個密碼子,刪除了其本身固有的停止標(biāo)記,該停止標(biāo)記可終止蛋白質(zhì)合成。他們將“停止”密碼子進(jìn)行了修改,使之編碼了一種新型氨基酸,并以“即插”方式插入到基因組中。新基因組能限制病毒用來感染細(xì)胞的一種天然蛋白質(zhì)的生產(chǎn),從而讓細(xì)菌擁有了抵抗病毒感染的能力。
創(chuàng)造一種基因組重編碼的生物,使其造出強大的新型蛋白質(zhì)用于各種目的:從對抗疾病到制造新材料,提高了研究人員改造自然的能力。本研究標(biāo)志著人們首次能改變一個生物整個基因組的全部基因編碼。
艾薩克斯說,本研究為把重編碼細(xì)菌變成“活制造廠”搭建了廣闊舞臺,以生物制造方式創(chuàng)造出新型“特異”蛋白質(zhì)和高分子聚合物,而這些新型分子為新一代材料設(shè)計、納米結(jié)構(gòu)、治療方法及藥物遞送工具奠定了基礎(chǔ)?!坝捎诨蚓幋a是通用,本研究也為重新編程其他生物的基因組帶來了光明前景,并對生物技術(shù)行業(yè)帶來巨大的影響,有可能開辟出全新的研究與應(yīng)用之路?!?/p>
總編輯圈點
包括人在內(nèi)的各種生物主導(dǎo)著世界。而讓生物千差萬別,世界豐富多彩的,正是基因。科學(xué)家進(jìn)行基因研究、破譯基因組密碼的最終目的,就是為了有朝一日能夠自如地改寫、甚至編排這個世界上最神奇和復(fù)雜的密碼。如今美國科學(xué)家在這一領(lǐng)域占得先機,第一次從根本上改變了遺傳密碼??梢哉f,這是人類有能力對生物遺傳密碼重新改寫的重要證明。如果有一天真正擁有了“上帝之手”,對人類和世界而言到底是喜是憂?而這雙“手”又是否真的無所不能?這一切真讓人既憧憬又緊張。
(1)鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease,ZFN):是第一代人工核酸內(nèi)切酶
(2)類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN):第二代人工核酸酶。
(3)Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 第三代人工核酸內(nèi)切酶(前兩代就是ZFN和TAILEN)。
(4)人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease,EEN)
Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)研究,而張峰和George Church在各種人類細(xì)胞中的應(yīng)用方面貢獻(xiàn)較多,其中張鋒對CRISPR/Cas9技術(shù)方面的改進(jìn)也有突出的貢獻(xiàn)。
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR) :是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的有規(guī)律成簇又帶間隔的短回文序列,可以幫助細(xì)菌抵抗噬菌體的入侵,是細(xì)菌針對噬菌體的獲得性免疫。 CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng) 。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后,能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時,細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識別病毒,將病毒的DNA切斷而使之失效。
CRISPR locus是由幾個原件構(gòu)成,如下圖:一開始是個反向轉(zhuǎn)錄的RNA,是特異的非編碼RNA,可以和重復(fù)序列部分互補(trancrRNA,橙色矩形),后面是各種cas基因(箭頭表示),接著是CRISPR排列(棕色的菱形是重復(fù)序列,彩色的是間隔)。而這些間隔序列是細(xì)菌從噬菌體DNA中獲得的遺傳序列:當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌,細(xì)菌激活相關(guān)的cas基因——Cas1,Cas2,和Csn2,將其中新的間隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦獲得新的間隔序列以后,新的spacer就會出現(xiàn)在pre-crRNA中,此時tracrRNA與不同的SPACER互補,在RNaseIII的作用下,產(chǎn)生crRNA,進(jìn)一步在其他未知的核酸酶的作用,剪切crRNA的5'端, 使得引導(dǎo)序列長為20nt 。如果噬菌體注入DNA,那么這個免疫系統(tǒng)將被激活,來干擾剪切噬菌體DNA,起到獲得性免疫作用。
經(jīng)過廣譜檢測,人們發(fā)現(xiàn)了三種主要的CRISPR系統(tǒng),它們由CRISPR-associated (Cas)基因、非編碼rna和一組獨特的重復(fù)元素(直接重復(fù))組成,而這些重復(fù)序列則由來自外源性DNA靶點(即原間隔體)的短可變序列直接間隔開來;重復(fù)序列+間隔序列=CRISPR RNA (crRNA) array。在有DNA靶點的情況下,每一個間隔序列都有一個前間區(qū)序列鄰近基序(PAM——Ⅱ型系統(tǒng)的PAM基序為 5-NGG-3 )。
II型CRISPR系統(tǒng)是最具特征的系統(tǒng)之一,它由核酸酶Cas9、編碼引導(dǎo)rna的crRNA陣列和有助于將crRNA陣列加工成離散單元的所需輔助反式激活crRNA (tracrRNA)組成
S. pyogenes亞型II-A Cas9(1368個氨基酸)是基因組工程中研究最多、使用最多的Cas9版本。其優(yōu)勢是:氨基酸序列相對較小,方便操作,且只是需要一個DNA內(nèi)切酶Cas9來對與sgRNA20個互補堿基的帶有PAM結(jié)構(gòu)的DNA進(jìn)行剪切。剪切后是DNA產(chǎn)生平末端的DSB(雙鏈斷裂),然后在進(jìn)行非同源的末端連接(NHEJ)過程中,容易隨機插入或者刪除或者替換。或者進(jìn)行高保真的同源定向修復(fù)(HDR),修復(fù)DNA。
CRISPR RNA (crRNA) array,編碼gRNA,再加上tracrRNA,則可達(dá)到定位+編輯的功能 ,gRNA用于引導(dǎo),tracrRNA用于結(jié)合靶點。把crRNA和tracrRNA合在一起,成為了single-guide RNA,即 sgRNA ,而通過修改tracrRNA的序列,在理論上可以on-target任何目的靶點。
這項技術(shù)主要由sgRNA定位到一個基因位點上,由Cas9酶在該位點進(jìn)行DNA雙鏈的切割,切割導(dǎo)致DNA修復(fù)通路的激活,使得其它的堿基加入進(jìn)切割的位點,造成frameshift突變,使得基因無法被表達(dá)成功能性蛋白。
Cas9造成基因不被表達(dá)是由NHEJ修復(fù)通路引起,然而,Cas9造成的DSB并不一定會引發(fā)NHEJ,因為DSB end的堿基并沒有任何損壞,這種end也叫blunt end,很容易再次粘連在一起,此時可以通過外源性同源重組引入Gene drive,或者說blunt end再次粘連在一起,sgRNA也會會再次識別這段序列,然后Cas9會再次切,反復(fù)下去,直到發(fā)生了由NHEJ引導(dǎo)出的突變,sgRNA才不會識別這段序列。
CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)構(gòu)成 。
①前導(dǎo)序列 :富含AT堿基,位于CRISPR基因上游, 被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動子 。
②重復(fù)序列 :長度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu), 穩(wěn)定RNA的整體二級結(jié)構(gòu) 。
③間隔序列 : 是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列 。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”,當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時,CRISPR/Cas系統(tǒng)就會予以精確打擊。
化膿性鏈球菌 Cas9(以下稱為SpyCas9)是大型(1,368個氨基酸)多結(jié)構(gòu)域和多功能DNA核酸內(nèi)切酶。它通過其兩個不同的核酸酶結(jié)構(gòu)域在PAM上游剪接dsDNA 3 bp:一個HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域,其切割與指導(dǎo)RNA序列互補的DNA鏈(靶鏈),以及一個RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域,其負(fù)責(zé)切割DNA。與互補鏈相反的鏈(非目標(biāo)鏈)。除了在CRISPR干擾中起關(guān)鍵作用外,Cas9還參與crRNA成熟和間隔區(qū)獲取。
先簡單介紹一下張鋒實驗室的CRISPR DOUBLE NICKASE
和普通Cas9不同的是,Cas9n (Cas9 Nickase)上有一個D10A的氨基酸突變,這個突變使得Cas9不再導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和NHEJ修復(fù)(一種會引來突變的修復(fù)),而是會引起單鏈斷裂和BER修復(fù)(一種不會引起突變的修復(fù)),如下圖
利用Cas9 nickase只能進(jìn)行單鏈剪切的特性,張峰團隊想到把兩個Cas9 nickase共同作用在一個基因位點上,使其形成雙鏈斷裂(DSB),而非特異性結(jié)合則不會引起DSB,這樣就降低了非特異性突變。
Cas9可以對靶基因組進(jìn)行剪切,形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下,細(xì)胞會采用高效的 非同源末端連接 方式(NHEJ)對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。但是,在修復(fù)過程中通常會發(fā)生堿基插入或缺失的錯配現(xiàn)象,造成移碼突變,( 移碼突變 :是指DNA分子由于某位點堿基的缺失或插入,引起閱讀框架變化,造成下游的一系列密碼改變,使原來編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列。)使靶標(biāo)基因失去功能,從而實現(xiàn)基因敲除。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性,可將Cas9的一個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變,形成只能對DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計兩條sgRNA序列,分別靶向DNA互補的兩條鏈,這樣兩條sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列,即可形成DNA斷裂,并在修復(fù)過程中通過移碼突變實現(xiàn)基因敲除
當(dāng)DNA雙鏈斷裂后,如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中,基因組斷裂部分會依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行 同源重組修復(fù) (HDR),從而實現(xiàn)基因敲入。修復(fù)模板由需要導(dǎo)入的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列(同源臂)組成,同源臂的長度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈,也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低,通常小于10%。為了增加基因敲入的成功率,目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率,將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時期,促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行;或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ,提高HDR的效率
Cas9的特點是能夠自主結(jié)合和切割目的基因,通過點突變的方式使Cas9的兩個結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性,形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因,而不具備剪切DNA的功能。因此,將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點,可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開始,從而抑制基因表達(dá);將dCas9結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物,使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于,dCas9造成的激活或者抑制是可逆的,并不會對基因組DNA造成永久性的改變。
將多個sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中,可同時對多個基因進(jìn)行編輯,具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括:使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率、大范圍的基因組缺失及同時編輯不同的基因。通常情況下,一個質(zhì)粒上可以構(gòu)建2~7個不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯。
利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞,因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的?;蚪M篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù),但是shRNA有其局限性:具有很高的脫靶效應(yīng)以及無法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果。CRISRP-Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢,在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因,如對化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫對潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。
1 重生細(xì)胞愿望變異的位置在基因組的某個地方。
2 在我們體內(nèi)的細(xì)胞中,基因組指的是細(xì)胞核內(nèi)所有染色體的DNA分子的總和。
這些DNA分子包含了我們所有的基因,而基因又決定了我們身體的各種特征。
當(dāng)某個基因突變或發(fā)生變異時,就會影響到一些特定的生理功能。
重生細(xì)胞愿望變異也是一種基因突變,可能是由于某些因素導(dǎo)致基因發(fā)生了變異,使得細(xì)胞的再生和修復(fù)能力發(fā)生了變化。
3 目前,重生細(xì)胞愿望變異的具體位置和機制還需要進(jìn)一步的研究和探索。
但是,可以肯定的是,如果我們能夠掌握這種變異的機制和方法,就有可能利用它來治療許多難以治愈的疾病,這對于人類健康事業(yè)將是一個巨大的進(jìn)步。
本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/139510.html.
聲明: 我們致力于保護(hù)作者版權(quán),注重分享,被刊用文章因無法核實真實出處,未能及時與作者取得聯(lián)系,或有版權(quán)異議的,請聯(lián)系管理員,我們會立即處理,本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò),轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益,請立即通知我們(管理員郵箱:602607956@qq.com),情況屬實,我們會第一時間予以刪除,并同時向您表示歉意,謝謝!