專訪上海巴斯德研究所張巖博士—如何降低crispr/cas9脫靶率

基因編輯能夠幫助人類實(shí)現(xiàn)"編輯"基因，完成特定dna片段的敲出、加入等，而近年來(lái)風(fēng)光無(wú)限的crispr/cas9技術(shù)更是能將是具有其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，能在不同物種中實(shí)現(xiàn)最有效、最便捷的基因刪除或插入。

但是隨著這一系統(tǒng)越來(lái)越受歡迎，關(guān)于其特異性和有效性的質(zhì)疑也越來(lái)越多。在特異性上，一方面可能把無(wú)意義的片段帶入靶向的基因組中，另一方面靶向編輯的效率太低，在靶向的位點(diǎn)上可能出現(xiàn)錯(cuò)誤。在有效性上，脫靶經(jīng)常出現(xiàn)，對(duì)脫靶的控制、處理成為重要問(wèn)題。

本次記者有幸采訪到了中科院張巖博士。張巖博士2010年獲得中科院百人計(jì)劃入選資格，目前擔(dān)任中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所造血干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究組組長(zhǎng)，是正高級(jí)工程師。張巖博士也將出席8月12日-14日，由生物谷主辦的基因編輯培訓(xùn)。張巖博士將與我們分享基因編輯技術(shù)中如何提高導(dǎo)向rna（grna）的特異性、如何降低脫靶率，提高編輯效率及如何敲除大片段的基因等精彩內(nèi)容。

您認(rèn)為利用crispr/cas9技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，最大的挑戰(zhàn)是哪一步？

回答：crispr/cas9技術(shù)在細(xì)胞系或小鼠定點(diǎn)基因操作方面有較多應(yīng)用。目前，利用crispr/cas9引入indel 突變，對(duì)細(xì)胞系或小鼠進(jìn)行基因敲除效率非常高；而利用crispr/cas9技術(shù)進(jìn)行基因定點(diǎn)敲入，尤其是大片段dna的基因定點(diǎn)敲入，效率還是不太高，應(yīng)該是比較大的挑戰(zhàn)。

crispr/cas9技術(shù)在實(shí)際操作中，往往會(huì)產(chǎn)生一些脫靶的問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們可以通過(guò)哪些措施盡量避免？

回答：盡量sgrna專業(yè)設(shè)計(jì)的網(wǎng)站進(jìn)行sgrna的設(shè)計(jì)。可以對(duì)可能的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，以排除脫靶的可能。另外，利用cas9（d10a）nickase以及兩條sgrna

在實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)打靶敲除和敲入的大片段，如何設(shè)計(jì)能提高打靶效率？

回答：無(wú)論是細(xì)胞還是小鼠，利用crispr進(jìn)行基因敲除的效率非常高，而在進(jìn)行大片段dna基因敲入效率較低。大片段dna基因敲入的過(guò)程是個(gè)同源重組的過(guò)程，需要使用打靶載體，打靶載體同源臂需要足夠長(zhǎng)（我們自己實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)是上下游的同源臂至少各1kb）。另外，如果是在細(xì)胞中進(jìn)行基因敲入，打靶載體上最好有抗性基因，能夠顯著增加打靶的效率。在小鼠中進(jìn)行大片段的基因敲入，我們目前還是先在小鼠es細(xì)胞中進(jìn)行定點(diǎn)基因敲入，然后通過(guò)顯微注射獲得嵌合鼠，最后獲得大片段基因敲入小鼠。

最近韓春雨的ngago技術(shù)很火熱，您認(rèn)為這一技術(shù)和crispr/cas9技術(shù)相比，區(qū)別有哪些？

回答：ngago系統(tǒng)還需要其他實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將來(lái)會(huì)有一個(gè)比較清晰的結(jié)論。crispr技術(shù)所使用的sgrna，可以用u6啟動(dòng)子在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這在未來(lái)的臨床實(shí)踐中比較方便；ngago使用的5'-磷酸化的單鏈gdna，目前還無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)合成，只能依靠體外合成然后轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，因此未來(lái)在臨床實(shí)踐中的使用受到限制。但在實(shí)驗(yàn)室使用階段，可以將5'-磷酸化的單鏈gdna通過(guò)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，或通過(guò)顯微操作注射到小鼠受精卵中，使用還是比較方便。

您帶領(lǐng)的造血干細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究組，最近取得了哪些新的進(jìn)展？

回答：利用crispr技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)參與造血干細(xì)胞"自我更新"與造血重建調(diào)節(jié)的候選基因，進(jìn)行快速、高通量的篩選。我們最近利用crispr技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)我們感興趣的一百余種表觀遺傳調(diào)控因子進(jìn)行體內(nèi)功能篩選。其中，我們用到的小鼠，是mit zhang feng實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的rosa26-lsl-cas9-egfp工具小鼠。由于cas9酶已經(jīng)被敲入到小鼠基因組中并在骨髓細(xì)胞中表達(dá)，因此只要將含有sgrna的慢病毒感染骨髓細(xì)胞，然后進(jìn)行骨髓移植即可。這種策略，大大加速了我們對(duì)造血干細(xì)胞功能研究的進(jìn)度。相信這種策略，稍加改進(jìn)，也可以用在其他的研究領(lǐng)域。

基因編輯技術(shù)是什么？它是如何在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的？

基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，到現(xiàn)在已發(fā)展到第三代基因編輯技術(shù)。第三代基因技術(shù)CRISPR/Cas克服了傳統(tǒng)基因操作的周期長(zhǎng)、效率低、應(yīng)用窄等缺點(diǎn)。作為一種最新涌現(xiàn)的基因組編輯工具，CRISPR/Cas能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識(shí)別以及編輯。通過(guò)一段序列特異性向?qū)NA分子（sequence- specific guide RNA）引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶序列處，從而完成基因組的精確編輯，因其操作簡(jiǎn)單、成本低、高效率，近幾年成為炙手可熱的基因編輯手段，目前已廣泛用于模式生物研究，醫(yī)療，植物作物，農(nóng)業(yè)畜牧等領(lǐng)域。

1 磨快CRISPR利器，加快科學(xué)發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的出現(xiàn)給了科研人員無(wú)限想象的可能，基于CRISPR/Cas9的技術(shù)很快就被廣泛應(yīng)用于全世界各個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，這里我們將主要介紹最常用的幾種應(yīng)用。

早期，科研人員通過(guò)同源重組（HR）介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯，但因效率太低，極大地限制了其應(yīng)用。為了克服這一難題，一系列通過(guò)核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)被開發(fā)出來(lái)，通過(guò)這些核酸內(nèi)切酶切割特定的基因組序列，借助細(xì)胞自身修復(fù)體系如非同源末端連接或同源重組修復(fù)方式，并由此達(dá)到改變基因組序列的目的，鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶正是基于此原理工作的。

鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）均可通過(guò)蛋白-DNA相互作用識(shí)別基因組上的特定DNA序列并完成特定位點(diǎn)的切割，但是它們因效率低下、可選潛在位點(diǎn)少、成本高等原因極大地限制了它們的應(yīng)用，直到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)，科研人員才找到了一種成本低、效率高、簡(jiǎn)單易用的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9出現(xiàn)之后，科研人員最先想到的便是將其運(yùn)用到基因編輯上了，根據(jù)目標(biāo)基因的外顯子序列設(shè)計(jì)single guide RNA（sgRNA）并與含有Cas9編碼序列的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞，sgRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則引導(dǎo)Cas9蛋白靶向目標(biāo)DNA序列，Cas9蛋白會(huì)在該位點(diǎn)切割DNA，引發(fā)DNA雙鏈斷裂（DSB），此時(shí)細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）完成DNA的自身修復(fù)，

因修復(fù)過(guò)程中常常發(fā)生堿基的添加和丟失，而最終導(dǎo)致基因的移碼突變從而達(dá)到基因敲除的目的，或者針對(duì)目的基因的上下游序列各設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA，從而引發(fā)該基因上下游同時(shí)發(fā)生DSB，再通過(guò)DNA損傷修復(fù)機(jī)制將斷裂的上下游兩端的DNA連接在一起，引發(fā)DNA片段缺失，從而達(dá)到基因敲除的目的。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒，細(xì)胞就會(huì)以此模板進(jìn)行同源重組修復(fù)，如果引入的修復(fù)模板是一個(gè)想要插入的基因，便可在特定的位置進(jìn)行基因敲入了。

2 神奇的dCas9多功能工具包隨著人們對(duì)Cas9研究的不斷深入，Cas9發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也漸漸明確，在Cas9發(fā)揮切割DNA的功能時(shí)，它的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著重要作用，分別是RuvC和HNH，其中HNH結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)sgRNA互補(bǔ)鏈的切割，切割的位點(diǎn)位于PAM的5'端的第三個(gè)堿基外側(cè)，RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)非互補(bǔ)鏈的切割，切割位點(diǎn)是在PAM上游的3-8堿基之間，當(dāng)將這二者同時(shí)突變失活，便產(chǎn)生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9雖然失去了對(duì)DNA的切割能力，但依舊可以在sgRNA的引導(dǎo)下到達(dá)指定的DNA序列處，這是基于sgRNA–dCas9復(fù)合體的這一特征，若在dCas9上融合不同功能的結(jié)構(gòu)域，便可在特定的DNA區(qū)域完成不同的修飾了，這便形成了基于CRISPR/dCas9的工具包了。

腦洞大開的科學(xué)家利用dCas9蛋白，開發(fā)出各種用途的工具，可謂是把CRISPR/dCas9利用得淋漓盡致，這里我們舉幾個(gè)簡(jiǎn)單的例子如研究人員針對(duì)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)sgRNA，使得sgRNA–dCas9復(fù)合體靶向結(jié)合到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子上，因dCas9蛋白帶來(lái)的空間位阻可干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而引發(fā)在轉(zhuǎn)錄水平上的干擾基因表達(dá)的效果，而在此基礎(chǔ)上為了達(dá)到更佳的干擾效果，一些能夠引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄阻遏的結(jié)構(gòu)域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

既然可以通過(guò)CRISPR/dCas9實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的干擾，那是不是也可以通過(guò)CRISPR/dCas9實(shí)現(xiàn)激活基因表達(dá)呢？答案是肯定的?？蒲腥藛T通過(guò)向dCas9上融合vp64（四個(gè)串聯(lián)的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促進(jìn)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域，實(shí)現(xiàn)基因的內(nèi)源性激活，在經(jīng)過(guò)各種優(yōu)化之后，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）組成的三聯(lián)結(jié)構(gòu)域（dCas9–VPR）就可以實(shí)現(xiàn)很高水平的內(nèi)源性激活基因表達(dá)的效果了。

通過(guò)基于CRISPR/dCas9的基因表達(dá)干擾和內(nèi)源性激活工具的建立，使得科研人員在進(jìn)行諸如基因功能研究的工作時(shí)有了更為簡(jiǎn)單、高效且低成本的研究工具。這很大程度上為科研人員節(jié)約了時(shí)間和成本。

3 精準(zhǔn)編輯表觀遺傳修飾表觀遺傳研究是近些年來(lái)非?；馃岬念I(lǐng)域，DNA甲基化、組蛋白乙?；榷荚谏矬w中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，而CRISPR/dCas9在表觀遺傳的研究中也成為了十分強(qiáng)大的工具。比如CRISPR/dCas9介導(dǎo)的靶向DNA甲基化修飾，我們知道在DNA甲基化過(guò)程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起著關(guān)鍵的催化作用，而且大部分DNA甲基化都發(fā)生在CpG島，

因此研究人員嘗試著將DNMTs的催化結(jié)構(gòu)域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，并通過(guò)sgRNA的引導(dǎo)靶向目標(biāo)DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以實(shí)現(xiàn)DNA甲基化的定點(diǎn)編輯。相似地，研究人員將在DNA去甲基化過(guò)程中起關(guān)鍵催化作用的TET1蛋白的催化結(jié)構(gòu)域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同樣的通過(guò)sgRNA的引導(dǎo)靶向目標(biāo)DNA序列的CpG附近，可以實(shí)現(xiàn)去甲基化修飾。

再如CRISPR/dCas9介導(dǎo)的靶向組蛋白修飾，與靶向DNA甲基化修飾相似，一些和組蛋白修飾相關(guān)的酶包括組蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以實(shí)現(xiàn)靶向組蛋白修飾。

除以上的應(yīng)用外，CRISPR/dCas9還被用于其他多個(gè)領(lǐng)域，比如將EGFP融合到dCas9上，通過(guò)sgRNA靶向特定DNA序列實(shí)現(xiàn)基因組成像。此外，還有研究人員開發(fā)出基于CRISPR/dCas9的enChIP技術(shù)，以來(lái)探測(cè)特定基因組區(qū)域上的DNA-蛋白質(zhì)相互作用，通過(guò)sgRNA靶向特定基因組基因座的標(biāo)記dCas9的抗體免疫沉淀，之后通過(guò)蛋白質(zhì)譜（enChIP-MS），鑒定與之特異性相互作用的蛋白質(zhì)。這些工具的開發(fā)都極大地幫助了科研人員，使得之前無(wú)法實(shí)現(xiàn)的操作成為可能，推動(dòng)了生命科學(xué)的快速發(fā)展。

4 基因及藥物靶標(biāo)基因的確定以往基于ZFN或TALENs的基因組編輯技術(shù)，需要針對(duì)DNA靶序列設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)，而CRISPR技術(shù)僅需要根據(jù)不同的靶序列合成相應(yīng)的80nt左右的sgRNA來(lái)引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)序列進(jìn)行修飾，這就實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)的高通量應(yīng)用。

CRISPR全基因組篩選技術(shù)可用于必需基因及藥物靶標(biāo)基因鑒定。多倫多大學(xué)Jason Moffa研究組建立了覆蓋全基因組gRNA庫(kù)并在5個(gè)細(xì)胞系中逐個(gè)敲除了1.8萬(wàn)個(gè)基因，最后鑒定出在不同細(xì)胞系間保守的1580個(gè)必需基因構(gòu)成的“core fitness genes”。

同樣，美國(guó)達(dá)納-法伯癌癥研究所W. Nick Haining研究組通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)性地敲除了黑色素瘤細(xì)胞的2368個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)ptpn2基因缺失會(huì)使這些癌細(xì)胞對(duì)PD-1阻斷更加敏感。華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Michael Diamond研究組利用CRISPR/Cas9鑒定在宿主細(xì)胞中堅(jiān)定了黃病毒感染所絕對(duì)必需的9個(gè)基因，其中spcs1基因缺失時(shí)，不僅降低黃病毒感染率，而且對(duì)細(xì)胞也不產(chǎn)生副作用，這將是一個(gè)潛在的黃病毒藥物靶標(biāo)。

5 疾病建模及器官供體產(chǎn)生CRISPR/Cas9作為新一代基因編輯技術(shù)，同樣可被應(yīng)用于建立疾病模型及培育供體器官。基因治療可實(shí)現(xiàn)在患者自身細(xì)胞中糾正遺傳缺陷，并結(jié)合其他生物學(xué)技術(shù)在體外培育出組織特異性的“類器官”，對(duì)于疾病建模、藥物篩查及臨床治療等方面研究有極大意義。CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可以直接應(yīng)用于非人類哺乳動(dòng)物的疾病模型建立，將更有利于疾病致病機(jī)理和治愈研究。

此外，CRISPR技術(shù)還可應(yīng)用于大型動(dòng)物的基因編輯以研究免疫排斥及跨物種的疾病傳染，從而解決異種移植器官來(lái)源的瓶頸，豬被認(rèn)為是人體異種器官來(lái)源的首選動(dòng)物，而目前豬器官用于人類的主要障礙為免疫排斥反應(yīng)，及豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）帶來(lái)的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。eGenesis公司楊璐菡博士與哈佛大學(xué)George Church教授利用CRISPR進(jìn)行基因改造一步讓62個(gè)PERV pol 基因關(guān)閉，因而將來(lái)自PERV的傳染風(fēng)險(xiǎn)降低了三個(gè)數(shù)量級(jí)，成功培育出不含PERVs的豬品系，作為安全有效的異種移植器官來(lái)源，這些研究讓豬成為病人的器官來(lái)源更有前景。

6 基因療法基因編輯技術(shù)可以準(zhǔn)確地改造人類基因，達(dá)到基因治療效果。中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松研究組通過(guò)在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內(nèi)障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產(chǎn)生的后代是可育的并能將修正后的等位基因傳遞給它們的后代。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）是一種罕見(jiàn)的肌肉萎縮癥，也是最常見(jiàn)的致命性遺傳病之一，是由肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學(xué)Charles Gersbach研究組應(yīng)用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個(gè)截短的但功能很強(qiáng)的抗肌萎縮蛋白，這是生物學(xué)家“首次成功地利用CRISPR基因編輯技術(shù)治愈了一只成年活體哺乳動(dòng)物的遺傳疾病”。

??CAR-T治療簡(jiǎn)圖，圖片來(lái)自onclive.com

基因編輯技術(shù)聯(lián)合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應(yīng)用前景。嵌合抗原受體T細(xì)胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細(xì)胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細(xì)胞療法在B細(xì)胞惡性血液腫瘤治療中已經(jīng)取得碩果。中科院動(dòng)物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術(shù)在CAR-T細(xì)胞中進(jìn)行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國(guó)斯隆凱特林癌癥紀(jì)念中心Michel Sadelain研究組發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR基因特異性靶向插入到細(xì)胞的TRAC基因座位點(diǎn)，極大增強(qiáng)了T細(xì)胞效力，編輯的細(xì)胞大大優(yōu)于傳統(tǒng)在急性淋巴細(xì)胞白血病小鼠模型中產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞。

繼諾華的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)開發(fā)同種異體CAR-T候選產(chǎn)品。2016年10月，四川大學(xué)華西醫(yī)院的腫瘤醫(yī)生盧鈾領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)首次在人體中開展CRISPR試驗(yàn)，從晚期非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)提取出免疫細(xì)胞，再利用CRISPR/Cas9技術(shù)剔除細(xì)胞中的PD-1基因更有助于激活T細(xì)胞去攻擊腫瘤細(xì)胞，最后將基因編輯過(guò)的細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)。

7 致病菌及抗病毒研究微生物種群與人體醫(yī)學(xué)，自然環(huán)境息息相關(guān)。北卡羅來(lái)納大學(xué)Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過(guò)使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統(tǒng)可靶向并區(qū)分高度密切相關(guān)的微生物，并程序性去除細(xì)菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統(tǒng)可開發(fā)成精細(xì)微生物治療體系來(lái)剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學(xué)Udi Qimron將CRISPR系統(tǒng)導(dǎo)入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細(xì)菌以消滅此類細(xì)菌，CRISPR系統(tǒng)已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發(fā)在噬菌體中開發(fā)CRISPR系統(tǒng)以達(dá)消滅難辨梭菌的目的。

弗吉尼亞理工大學(xué)Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進(jìn)行M因子基因編輯，可以導(dǎo)致雌雄蚊之間的轉(zhuǎn)化或雌蚊的殺戮，從而實(shí)現(xiàn)有效的性別分離和有效減少蚊子的數(shù)量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

基于CRISPR治療不僅可以應(yīng)用于根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應(yīng)用于靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對(duì)HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學(xué)Yuet Wai Kan在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC中利用CRISPR系統(tǒng)引入純合CCR5Δ32突變后，誘導(dǎo)分化后的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)HIV感染具有抗性。天普大學(xué)Kamel Khalili 課題組應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在宿主細(xì)胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區(qū)，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

8 核酸診斷及細(xì)胞事件記錄Cas12a （Cpf1）屬于CRISPR家族另一核酸內(nèi)切酶，它也可被gRNA引導(dǎo)并剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結(jié)合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發(fā)了基于CRISPR的一項(xiàng)新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構(gòu)建成一個(gè)報(bào)告系統(tǒng)，當(dāng)CRISPR-Cas12a在gRNA引導(dǎo)下結(jié)合到目標(biāo)DNA并發(fā)揮剪切作用時(shí)，報(bào)告系統(tǒng)中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統(tǒng)在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測(cè)HPV16和HPV18變現(xiàn)極佳。

布羅德研究所Feng Zhang研究組開發(fā)的基于CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活后，可以切割除靶序列外其他的RNA的特征，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實(shí)現(xiàn)一次性多重核酸檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)4種靶標(biāo)分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，并將它開發(fā)成微型試紙條檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單明了易操作，已被研究人員成功應(yīng)用于RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測(cè)。

Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發(fā)了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細(xì)胞事件的“黑匣子”他們利用這個(gè)系統(tǒng)開發(fā)出兩種細(xì)胞記錄系統(tǒng)，在第一種被稱為“CAMERA 1”的細(xì)胞記錄系統(tǒng)中，研究人員利用細(xì)菌中質(zhì)粒的自我復(fù)制但又嚴(yán)格控制其自身數(shù)量的特征，

將兩種彼此之間略有不同的質(zhì)粒以穩(wěn)定的比例轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中，隨后在接觸到外來(lái)藥物刺激時(shí)，利用CRISPR/Cas9對(duì)這兩種質(zhì)粒中的一種進(jìn)行切割，通過(guò)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序并記錄兩種質(zhì)粒比例的變化來(lái)記錄細(xì)菌接觸外來(lái)刺激的時(shí)間。另一種細(xì)胞記錄系統(tǒng)被稱為“CAMERA 2”，它利用基于CRISPR/Cas9的堿基編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)特定信號(hào)發(fā)生時(shí)改變遺傳序列中的單個(gè)堿基，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)諸如感染病毒、接觸營(yíng)養(yǎng)物等刺激的記錄。這套技術(shù)的出現(xiàn)將很大程度的幫助人們進(jìn)一步了解細(xì)胞的各類生命活動(dòng)的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

9 人類胚胎基因組編輯2015 年 4 月，中山大學(xué)的黃軍利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，同源重組修復(fù)了胚胎中一個(gè)引發(fā)地中海貧血β-globin gene （HBB）的突變。

??圖片來(lái)自kurzgesagt.org

2016年，廣州醫(yī)科大學(xué)的范勇團(tuán)隊(duì)在三原核受精卵中，應(yīng)用基因編輯技術(shù)CRISPR受精卵中的基因CCR5進(jìn)行編輯引入CCR5Δ32純合突變由于當(dāng)時(shí)脫靶效率問(wèn)題突出，產(chǎn)生了鑲嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)胚胎細(xì)胞和基因治療中心Shoukhrat Mitalipov研究組公布了其應(yīng)用CRISPR在人類胚胎中進(jìn)行DNA編輯的結(jié)果，糾正了突變的MYBPC3基因，其突變會(huì)引起心肌肥厚并將年輕運(yùn)動(dòng)員猝死。

CRISPR/Cas9：基因編輯的歷史與發(fā)展

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CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌特有的一種天然防御系統(tǒng)，用于抵抗病毒或外源性質(zhì)粒的侵害。當(dāng)外源基因入侵時(shí)，該防御系統(tǒng)的 CRISPR 序列會(huì)表達(dá)與入侵基因組序列相識(shí)別的 RNA，然后 CRISPR 相關(guān)酶(Cas)在序列識(shí)別處切割外源基因組DNA，從而達(dá)到防御目的。

根據(jù)Cas蛋白的特點(diǎn)，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要借助復(fù)雜的蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，Ⅱ型系統(tǒng)僅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可對(duì)靶目標(biāo)進(jìn)行編輯，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。

CRISPR/Cas自誕生以來(lái)，迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最耀眼、最有前景的技術(shù)。尤其是近兩年，在全世界科學(xué)家的共同努力下，CRISPR/Cas相關(guān)新進(jìn)展新突破不斷涌現(xiàn)。

一、基因編輯技術(shù)的發(fā)展史

基因編輯可以分為三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。這三個(gè)基因編輯技術(shù)都利用了DNA修復(fù)機(jī)制，所以我們先來(lái)了解一下DNA修復(fù)機(jī)制（ 圖1 ）。[圖片上傳失敗...(image-8dab49-1625385468208)]

圖1-NHEJ修復(fù)（左），HDR修復(fù)（右）

NHEJ（Non-homologous end joining）

非同源性末端接合

NHEJ修復(fù)機(jī)制不需要任何模版，修復(fù)蛋白直接將雙股裂斷的DNA末端彼此拉近，在DNA連接酶的幫助下重新接合（ 圖1 ）。

HDR（Homology directed repair）

同源重組修復(fù)

當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)存在與損傷DNA同源的DNA片段時(shí)，HDR才能發(fā)生。

NHEJ的機(jī)制簡(jiǎn)單又不依靠模版，因而NHEJ的活性相對(duì)于HDR高出許多。但NHEJ修復(fù)出錯(cuò)的概率較高，容易造成移碼突變等，基因編輯正是利用了這一點(diǎn)（ 圖1 ）。

1.ZFN的識(shí)別切割機(jī)制

融合鋅指模塊和FokI切割結(jié)構(gòu)域形成ZFN ；以二聚體的形式靶向切割每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；特異識(shí)別3個(gè)堿基；組裝多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(識(shí)別12-18bp)形成的ZFN對(duì)可特異切割基因組靶點(diǎn) （ 圖2 ）。

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圖2-ZFN基因編輯原理圖

2.TALEN的識(shí)別切割機(jī)制

兩個(gè)TALE靶向識(shí)別靶點(diǎn)兩側(cè)的序列；每個(gè)TALE融合一個(gè)FokI內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域；FokI通過(guò)TALE靶向形成二聚體切割靶點(diǎn)；設(shè)計(jì)靈活識(shí)別特異性強(qiáng)（ 圖3 ）。

[圖片上傳失敗...(image-6dcfc-1625385468209)]

圖3-TELEN基因編輯原理圖

3.CRISPR/Cas9的識(shí)別切割機(jī)制

crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA（ 圖4 ）。

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圖4-CRISPR/Cas9基因編輯原理圖

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比較

[圖片上傳失敗...(image-dd6344-1625385468209)]

圖5-三種基因編輯的比較

二、CRISPR/Cas技術(shù)的介紹

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)

1987年，在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的重復(fù)間隔序列——CRISPR序列，隨后，在其他細(xì)菌和古菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊序列。

2005年，發(fā)現(xiàn)這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說(shuō)明CRISPR 可能參與了微生物的免疫防御。

2011年，CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機(jī)制被揭示：當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時(shí)，CRISPR 轉(zhuǎn)錄生成 前體crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 經(jīng)過(guò)加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識(shí)別后，介導(dǎo) Cas 蛋白結(jié)合并切割，從而保護(hù)自身免受入侵。

2013年，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。隨后張鋒等使用CRISPR系統(tǒng)成功的在人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因編輯。

從此開始，CRISPR/Cas9技術(shù)給生命科學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了巨大沖擊，CRISPR/Cas9相關(guān)研究成果頻頻登上CNS等頂級(jí)期刊，近兩年更是成為諾貝爾獎(jiǎng)熱門候選。

CRISPR/Cas技術(shù)的原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA（trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過(guò)人工設(shè)計(jì) crRNA 和 tracrRNA 這兩種 RNA，改造成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （single guide RNA ），從而引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割（圖4）。

CRISPR/Cas技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)明的堿基互補(bǔ)設(shè)計(jì)原則，識(shí)別不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細(xì)胞任意序列，方便同時(shí)靶向多個(gè)靶點(diǎn)，切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脫靶效應(yīng)

PAM**** (Protospacer adjacent motif )

前間區(qū)序列鄰近基序

PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列 3′端沒(méi)有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會(huì)切割該序列位點(diǎn)。 PAM序列主要影響CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在細(xì)胞水平上，NGG介導(dǎo)的切割效率是最高的。

sgR****NA ****(Single guide RNA )

向?qū)?RNA

sgRNA與目標(biāo)基因組相結(jié)合的 20nt 序列區(qū)決定著 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靶向特異性。CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識(shí)別的特異性其實(shí)主要依賴于sgRNA與靠近PAM區(qū)的10~12 bp的堿基配對(duì)，而其余遠(yuǎn)離PAM序列 8~10 bp 堿基的錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)識(shí)別的影響并不明顯。目前研究結(jié)果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是決定特異性的關(guān)鍵，其他序列也均在不同程度上影響脫靶效應(yīng)。

CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)給研究帶來(lái)了一定程度上的不確定性，也是限制其發(fā)揮更大潛力的主要原因之一。

2017年5月30日，Nature 雜志子刊Nature Methods 刊登了美國(guó)哥倫比亞大學(xué)研究人員的一篇文章，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9成功修復(fù)了導(dǎo)致小鼠失明的基因后，對(duì)小鼠進(jìn)行全基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)修復(fù)后的小鼠基因組有超過(guò)1500個(gè)單核苷酸突變，以及超過(guò)100個(gè)位點(diǎn)發(fā)生大片段插入或缺失（ 圖6 ）。文章的結(jié)論無(wú)疑引發(fā)了巨大震動(dòng)，也給正在進(jìn)行中的CRISPR/Cas9帶來(lái)了不確定性。

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圖6--動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中CRISPR/Cas9編輯后發(fā)生意想不到的突變

仔細(xì)分析后，發(fā)現(xiàn)該文章并不十分嚴(yán)謹(jǐn)，文章僅有兩只小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，一只作為對(duì)照組，數(shù)量不足以證明結(jié)論是否只是個(gè)例。而且單堿基突變是生物體內(nèi)自然現(xiàn)象，不能全歸于CRISPR/Cas9。整個(gè)實(shí)驗(yàn)只基于一個(gè)sgRNA數(shù)據(jù)，且該sgRNA特異性評(píng)分很低，造成脫靶效應(yīng)也應(yīng)該在預(yù)料之中（ 圖7 ）。

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圖7--針對(duì)Nature Methods 文章的回應(yīng)

經(jīng)過(guò)一系列的研究和改進(jìn)，目前CRISPR系統(tǒng)的脫靶性已經(jīng)很低，當(dāng)然，要想達(dá)到理想的狀態(tài)，還有很長(zhǎng)的路要走。

四、CRISPR/Cas技術(shù)的進(jìn)展

2016年6月，張鋒在Science 發(fā)表文章，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a能有切割細(xì)菌的特定RNA序列。

2016年9月，Jennifer Doudna在Nature 發(fā)表文章，證實(shí)CRISPR/Cas13a可以用于RNA檢測(cè)。

2017年2月22日，美國(guó)紀(jì)念斯隆.凱特林癌癥中心（MSK）研究人員在Nature 雜志發(fā)文，使用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于CAR-T療法。該研究既解決了傳統(tǒng)CAR-T療法的隨機(jī)整合可能存在的潛在危害，又大大降低了CAR-T細(xì)胞發(fā)生分化或癌化的風(fēng)險(xiǎn)，賦予了CAR-T技術(shù)全新的高效性、穩(wěn)定性、安全性。

2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在Nature 發(fā)表長(zhǎng)文，使用CRISPR/Cas9技術(shù)修正了植入子宮前的人類胚胎中一種和遺傳性心臟病有關(guān)的變異。該研究證實(shí)了通過(guò)編輯人類胚胎進(jìn)行治療遺傳病是安全可行的。值得一提的是，該成果受到了基因編輯領(lǐng)域大牛George Church等人的質(zhì)疑。

2017年8月11日，楊璐菡等在Science 發(fā)表文章，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬基因組中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小豬。向最終實(shí)現(xiàn)使用豬器官進(jìn)行人體器官移植的終極目標(biāo)邁進(jìn)了一大步。

2017年9月，雜交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除與鎘吸收和積累相關(guān)基因的水稻育種成功。該研究從根本上解決了水稻鎘污染的問(wèn)題，將扭轉(zhuǎn)我國(guó)部分農(nóng)作物重金屬超標(biāo)的問(wèn)題，進(jìn)而改善部分人群重金屬慢性中毒的問(wèn)題。

2017年10月4日，張鋒在Nature 發(fā)表論文證實(shí)CRISPR/Cas13a能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編輯特定的RNA。CRISPR/Cas13a能夠達(dá)到RNAi相似的降低基因表達(dá)的效率，而且有更強(qiáng)的特異性，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)天然的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響更小。

2017年10月19日，Jennifer Doudna在Nature 發(fā)表文章，設(shè)計(jì)了高精確性的Cas9變體—HypaCas9。該研究極大地降低了Cas9的脫靶效應(yīng)，且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日，張鋒在Science 發(fā)表文章介紹CRISPR新系統(tǒng)--REPAIR，可以高效的進(jìn)行RNA的單堿基修復(fù)。因?yàn)椴桓淖僁NA序列，所以為通過(guò)基因編輯治療遺傳病而又不永久影響基因組提供了新可能。

2017年10月25日，哈佛大學(xué)Broad研究所的David Liu實(shí)驗(yàn)室在Nature 發(fā)表長(zhǎng)文，報(bào)道了新型腺嘌呤基因編輯器——ecTadA-dCas9，可以將A·T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換成G·C堿基對(duì)，該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了不依賴DNA斷裂即可進(jìn)行基因編輯的技術(shù)，即單堿基基因編輯技術(shù)。該技術(shù)高于其它基因組編輯方法的效率，且?guī)缀鯖](méi)有隨機(jī)插入、刪除或其它突變等不良副作用，因此為今后大范圍治療點(diǎn)突變遺傳疾病提供了極大的便利。

五****、展望

近幾年CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，推廣應(yīng)用到了生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測(cè)、腫瘤治療以及動(dòng)植物的改造、病原微生物防治等領(lǐng)域有著巨大的潛力，也將深遠(yuǎn)地影響整個(gè)世界。

特別感謝：BioArt主編給予的幫助和意見(jiàn)以及吉滿生物吳晨提供圖1-圖5的圖片。

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CRISPR/Cas9：精確編輯基因組的魔術(shù)剪刀？

1.什么是基因剪刀呢？

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌有一種能力極強(qiáng)的免疫系統(tǒng)：當(dāng)外來(lái)的病毒（噬菌體）感染細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌就利用身體里的一種酶（Cas9）來(lái)切斷外來(lái)病毒（噬菌體）的基因。這樣，外來(lái)的病毒（噬菌體）不能在細(xì)菌身體里復(fù)制了（繁殖了），就相當(dāng)于把病毒（噬菌體）間接殺死了，這樣細(xì)菌就不會(huì)得病了。

根據(jù)這種現(xiàn)象，32歲的中國(guó)留美博士張鋒（在美國(guó)麻省理工學(xué)院）發(fā)明了一種叫作CRISPR/Cas9的技術(shù)，也叫基因編輯技術(shù)，這種技術(shù)能對(duì)基因進(jìn)行剪切，形成了一套基因編輯系統(tǒng)，或許將來(lái)人們治病可以選擇“基因手術(shù)”。

我們知道，人生病大多是由于基因的關(guān)系。例如，人患癌癥，大多是由于基因突變。如果用CRISPR/Cas9技術(shù)將機(jī)體里發(fā)生突變的基因剪切掉，植入健康的基因，人的癌癥就會(huì)從根本上治愈。

2.基因編輯研究引起“科研潮”

CRISPR/Cas9技術(shù)研究成功以后，世界各國(guó)幾千個(gè)有關(guān)實(shí)驗(yàn)室都紛紛利用CRISPR/Cas9技術(shù)廣泛地開展著方方面面的研究，掀起了一股基因編輯研究熱潮。

例如，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所的研究人員，利用基因編輯技術(shù)對(duì)兩個(gè)品種的猴子進(jìn)行基因改造（學(xué)術(shù)用語(yǔ)叫基因修飾）。經(jīng)過(guò)基因修飾的猴子繁殖的后代，獲得了兩個(gè)基因靶向修飾的小猴子。這一研究工作引起了國(guó)外同行專家的特別關(guān)注，研究論文發(fā)表在美國(guó)《細(xì)胞》雜志上。

中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所的研究人員用該技術(shù)對(duì)水稻和小麥基因進(jìn)行修飾改造，從事育種研究，獲得成功。這一研究工作首次證實(shí)了CRISPR/Cas9技術(shù)能夠用于植物的基因編輯。研究論文刊登在美國(guó)《自然生物技術(shù)》雜志上。

中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的科研人員，用基因編輯技術(shù)治愈小白鼠的白內(nèi)障遺傳病。這一研究成果為疾病治療開辟了新徑。研究論文發(fā)表在美國(guó)《細(xì)胞·干細(xì)胞》雜志上。

3.艾滋病也能被根治嗎？

美國(guó)坦普爾大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究院主任卡邁勒·哈利利教授和他的同事利用基因編輯技術(shù)，首次成功地從人類細(xì)胞中徹底清除了潛在的艾滋病病毒（HIV-1病毒）。該項(xiàng)研究成果發(fā)表在美國(guó)《國(guó)家科學(xué)院院刊》上。研究人員認(rèn)為，這是朝著永久治愈艾滋病的方向邁出的重要一步。專家表示：“這是一項(xiàng)令人興奮的發(fā)現(xiàn)，不過(guò)現(xiàn)在還沒(méi)有準(zhǔn)備進(jìn)行臨床試驗(yàn)，它只是證明了我們正朝著正確的方向前進(jìn)?！?/p>

哈利利教授說(shuō)，因?yàn)榘滩〔《荆℉IV-1病毒）永遠(yuǎn)不會(huì)從人體的免疫系統(tǒng)消滅，只有用基因編輯技術(shù)徹底剪切病毒基因，才能根治艾滋病。

4.修飾人體免疫細(xì)胞

據(jù)最新消息，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研究人員，已成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾了人體T細(xì)胞。

T細(xì)胞是免疫細(xì)胞，改造能使其升級(jí)更具殺傷力。如艾滋病病毒感染人體時(shí)，就是利用其表面的CXCR4蛋白來(lái)感染T細(xì)胞，使其喪失了殺傷力。修飾T細(xì)胞使其表面的CXCR4蛋白失去活性后，艾滋病病毒就不能感染T細(xì)胞了。

在癌癥免疫療法中，此基因編輯技術(shù)能成功關(guān)閉PD-1蛋白分子，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞攻擊腫瘤。該技術(shù)修飾改造T細(xì)胞，對(duì)治療人體自身免疫疾病、癌癥、艾滋病等都是一個(gè)新的思路?？茖W(xué)家非常看好此技術(shù)，T細(xì)胞在血液中循環(huán)，能到達(dá)很多病灶，也方便從患者體內(nèi)采集，經(jīng)編輯后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，能更有針對(duì)性地治療（此成果見(jiàn)美國(guó)《國(guó)家科學(xué)院院刊》2015年7月刊）。

這種CRISPR/Cas9基因剪刀技術(shù)，是一種簡(jiǎn)便、價(jià)廉、多功能、高效率的新技術(shù)，它也因此被譽(yù)為“基因組編輯的魔術(shù)手術(shù)刀”。

（本文出自《知識(shí)就是力量》雜志2015年9月刊《基因剪刀——基因組編輯的魔術(shù)手術(shù)刀》，作者：張樹庸）

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