完成機(jī)構(gòu):中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹資源與改良研究中心、國家茶樹改良中心,杭州310008
構(gòu)建基因組文庫的步驟
A 分離基因組DNA;B 用超聲波或限制酶等進(jìn)行基因組DNA部分或完全降解;C 將降解物進(jìn)行分級得到所需大小DNA片段;D 將DNA片段與載體連接(一般用λ噬菌體載體);E 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞;F 最后篩選鑒定重組子克隆。
建立基因組文庫的方法2—λ噬菌體基因組文庫 可插入較大片段,最大可達(dá)23kb
建立基因組文庫的其他方法:cosmid基因組文庫 YAC基因組文庫 BAC基因組文庫
基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):
重組克隆的總數(shù)不宜過大, 以減輕篩選工作的壓力;載體的裝載量最好大于基因的長度, 避
免基因被分隔克??;克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域, 以利克隆排序;克隆片
段易于從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選
建立cDNA文庫的基本步驟
(1)隔離總RNA和凈化mRNA (2)合成的雙鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸適合插入一個克隆載體(3)克隆cDNA合適的向量(4)轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞的重組載體(5)篩查陽性克隆
cDNA克隆的策略
(1)自身引導(dǎo)的第二鏈合成+同聚物加尾(2)cDNA克隆方法的改進(jìn)。尾隨第一鏈寡核苷酸(DC)允許使用寡核苷酸引物( DG)將要開展的第二鏈(3)cDNA的定向克隆
從基因文庫中篩選分離目的基因克隆(1)制備核酸探針進(jìn)行雜交篩選(2) 制備抗體進(jìn)行免疫雜交篩選(3)根據(jù)生物大分子間的相互作用篩選目的基因(4)利用PCR技術(shù)篩選目的基因文庫(5)利用噬菌體表面展示技術(shù)分離目的cDNA克?。菏删w展示(phage display):是在噬菌體表面表達(dá)已融合到噬菌體外殼蛋白的重組蛋白或多肽的技術(shù)。
應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的關(guān)鍵是構(gòu)建表達(dá)性基因文庫,這種文庫稱為噬菌體展示文庫(phage display library )。
常用的構(gòu)建噬菌體顯示文庫的表達(dá)載體有兩類:絲狀噬菌體和以這些噬菌體復(fù)制起始序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的噬菌粒(phagemid)。
mRNA差別顯示技術(shù)原理:
在 mRNA3′端的 poly (A)5’上游的 2個堿基只有 1 2種組合。與此相對應(yīng),共可人工合成12種不同的下游引物,用以反轉(zhuǎn)錄mRNA 合成cDNA第一條鏈。這種引物通常稱為3’端錨定引物,它由Oligo-d T后面接上兩個堿基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)構(gòu)成。這樣,每一種此類人工合成的寡核苷酸引物,都將能夠把總mRNA群體的1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。由此可知,使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物,可以將整個mRNA群體在cDNA水平上,分成大致相等的但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。
DDRT-PCR的主要步驟:
Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA,并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物,合成第一鏈cDNA;Ⅱ.用5'隨機(jī)引物和某個3'端錨定引物對擴(kuò)增第一鏈(摻入32P-dNTP);Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物,X光片曝光后檢測差別條帶;Ⅳ.回收特異性差別條帶;Ⅴ.用同一引物對擴(kuò)增已回收的DNA條帶;Ⅵ.用Northern,Southern及測序法分析所得的條帶;Ⅶ.以該DNA片段做探針,篩選全長cDNA或核基因。
DNA插入誘變法分離目的基因
DNA插入誘變法主要用于植物目的基因的克隆分離研究。其基本原理是,當(dāng)一段特定的DNA序列插入到植物基因的內(nèi)部或其鄰近位置時,一般會誘導(dǎo)該基因發(fā)生突變形成突變體植株,或者在插入位置產(chǎn)生一個新的基因。 如果該DNA插入序列是已知的,便可用它作為DNA分子探針,從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選得到突變基因片段。然后利用此突變基因片段制備探針,從野生型植株的基因組DNA文庫中克隆出野生型的目的基因。這樣,插入的DNA序列相當(dāng)于在植物基因上貼了一張標(biāo)簽,因此,DNA插入誘變法又叫DNA標(biāo)簽法(DNA tagging)。
差別雜交和減法雜交技術(shù)分離目的基因
差別雜交
構(gòu)建了基因文庫后,如沒有任何可供選擇的探針進(jìn)行篩選,或沒有任何有關(guān)目的基因的核苷酸序列信息時,可以考慮用差別雜交法篩選目的基因片段。差別雜交(Differential hybridization)也稱為差別篩選(Differential screening)法。
特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長因子調(diào)控的基因,亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。
差別雜交的技術(shù)原理:有目的基因能正常表達(dá)和不能表達(dá)的兩個不同的細(xì)胞群體。
在這種情況下,分別制備兩種不同細(xì)胞群體的mRNA提取物,其中一個群體含有一定比例的目的基因mRNA ,另一個群體不含有目的基因mRNA。
差別雜交的技術(shù)原理過程:
以這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針,分別對由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行篩選。
當(dāng)以目的基因表達(dá)的mRNA群體為探針時,所有包含重組體的菌落都呈陽性反應(yīng),在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點;
而以目的基因不表達(dá)的mRNA群體為探針時,除了含有目的基因的菌落外,其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng),在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點。
比較這兩種底片并對照原平板,變可以挑選出含有目的基因的菌落,供進(jìn)一步研究用。
差別雜交法的局限性:首先,差別雜交的靈敏度比較低,不適合低豐度mRNA的目的基因的分離。其次,差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜,鑒定大量的噬菌斑,是一項十分耗時耗力的工作;第三,差別雜交重復(fù)性差。差別雜交涉及文庫的濾膜影印,不同濾膜之間的DNA保有量往往不均一,雜交所得的信號強(qiáng)度也會不一致,需要重新進(jìn)行點雜交,以做進(jìn)一步的陽性克隆鑒定工作 。
mRNA減法雜交基本原理:從表達(dá)目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成為cDNA,然后與無目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA做過量雜交,在兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成程cDNA/mRNA雙鏈雜交分子,而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍然保持單鏈狀態(tài),這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達(dá)的序列。
基因突變技術(shù)分為兩大類:位點特異性突變和隨機(jī)突變。位點特異性突變又分兩種類型:一類是通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變(oligonucleotide-mediated mutagenesis);第二類是利用PCR,以雙鏈DNA為模板所進(jìn)行的基因突變。
寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變的原理
使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物,啟動單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制,隨后這段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子鏈的組成部分。因此,所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列。要求所設(shè)計的寡核苷酸引物除了所需的突變位點之外,與目的基因編碼的區(qū)段完全互補(bǔ)。
作為誘變劑的寡核苷酸序列,同待誘變的目的基因的互補(bǔ)序列之間,能形成一種穩(wěn)定的唯一的雙鏈結(jié)構(gòu)。決定雙鏈區(qū)段穩(wěn)定性的主要因素是堿基的組分、核苷酸的錯配以及寡核苷酸引物的長度等。
寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變的基本步驟
(a)將要進(jìn)行突變的目標(biāo)基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌體載體或噬菌粒載體。(b)從重組的M13或噬菌粒中制備單鏈DNA。(c)將設(shè)計好的寡核苷酸突變引物的5’端用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化。(d)將上述突變引物與目標(biāo)基因(單鏈的DNA模板)進(jìn)行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情況下,使退火引物沿單鏈DNA模板延伸,然后新生鏈的末端用T4 DNA連接酶連接。(f)轉(zhuǎn)染易感細(xì)菌。(g)篩選出帶有突變的目標(biāo)基因的噬菌斑。(h)從突變的重組噬菌體制備單鏈DNA,通過DNA序列分析確認(rèn)突變位點的正確性。(i)從重組的M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA中回收突變的目標(biāo)基因(DNA片段)。(j)將突變了的基因(DNA片段)重組入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。
第五章
受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件
(1)便于重組DNA分子的導(dǎo)入。如易形成感受態(tài),具有較高的轉(zhuǎn)化效率;(2) 能使重組體DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。如限制性缺陷型; (3) 便于重組體的篩選。如具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀; (4) 受體細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性高,易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長,能進(jìn)行高密度培養(yǎng);對動物細(xì)胞要可懸浮培養(yǎng),對培養(yǎng)基適應(yīng)性要好;(5)安全性高,無治病性,不會對外界環(huán)境造成生物污染:感染與寄生缺陷型;(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累。尤其是對枯草芽孢桿菌。(7) 受體細(xì)胞的密碼子偏倚性要??;(8) 具有較好的翻譯后加工機(jī)制,便于真核目的基因的高效表達(dá)。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表達(dá);(9) 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值;(10)對于用于基因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體要用重組整合缺陷型。
第六章
克隆基因高表達(dá)的相關(guān)因素
1有效轉(zhuǎn)錄開始 關(guān)鍵的一步,并限制外源基因表達(dá)的一步!構(gòu)建表達(dá)載體的同時,選擇強(qiáng)的和可控制的啟動子和相關(guān)終止序列。
2有效延長和終止轉(zhuǎn)錄正確 3 mRNA的穩(wěn)定性4有效地轉(zhuǎn)錄開始5遺傳密碼子偏向6核糖核酸處理過程7終止密碼子8表達(dá)載體9重組蛋白
Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)
具有多順反子結(jié)構(gòu),基因排列次序為:啟動子(lacP)- 操縱基因(lacO) - 結(jié)構(gòu)基因(lacZ-lacY-lacA);正調(diào)節(jié)因子 CAP;負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I
Tac 表達(dá)系統(tǒng)
tac啟動子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜合啟動子。
調(diào)控模式與 lacUV5 相似,但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于 trp 和 lacUV5啟動子(P tac = 3 P trp = 11 P lac),因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下,選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。
包涵體蛋白
在一定條件下,外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起,形成無膜的裸露結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體(inclusion body, inclusive body)。
包涵體主要由蛋白質(zhì)組成,并且大部分為外源基因的表達(dá)產(chǎn)物,它們具有正確的氨基酸序列,但構(gòu)像卻是錯誤的,因而包涵體蛋白一般沒有生物學(xué)活性。
除此之外,包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。
包涵體形成的原因
主要因為在重組蛋白的表達(dá)過程中,缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過程中需要的酶和輔助因子,或環(huán)境不適,無法形成正確的次級鍵等原因形成的。此外,還有以下原因:
(1)表達(dá)量過高。(2) 重組蛋白的氨基酸組成(3)重組蛋白所處的環(huán)境:溫度、pH(4)缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類(5)培養(yǎng)條件不佳
酵母基因表達(dá)載體的種類
自主復(fù)制型質(zhì)粒載體:含酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和克隆位點等關(guān)鍵元件。較高拷貝數(shù),細(xì)胞分裂時不能平均分配到子細(xì)胞中。
整合型質(zhì)粒載體:不含酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū),但含有整合介導(dǎo)區(qū)。
著絲粒型質(zhì)粒載體:在自主復(fù)制型質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上構(gòu)建而成,增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件,可保證平均分配到子細(xì)胞中。1-2拷貝/細(xì)胞。
酵母人工染色體:以線性雙鏈DNA形式存在于酵母細(xì)胞,每個細(xì)胞只有單拷貝。
原核表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)調(diào)控方式 組成型,誘導(dǎo)型 表達(dá)產(chǎn)物定位 分泌型,不分泌型(細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞膜,周質(zhì)空間) 產(chǎn)物純化方式 是否融合蛋白,是否一步親和純化 產(chǎn)物溶解狀況 可溶,包含體,分泌型
在各種表達(dá)系統(tǒng)中,最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng),這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌),通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物,而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點:如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控,有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng),目的蛋白常以包涵體形式表達(dá),導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難;而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善,表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低
為克服上述不足,許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域,其優(yōu)點是
①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計,而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性,故不存在基因的非特異性激活或抑制
②能誘導(dǎo)基因高效表達(dá),可達(dá)105倍,為其他系統(tǒng)所不及;
③能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá),即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”,還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量
因此,利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前,基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
2RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外,這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù),更靈敏,更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行,然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下,在一只管中順次進(jìn)行。
逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三種活性:
1、 依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA第一條鏈
2、 Rnase水解活性:水解RNA雜合體中的RNA
3、 依賴DNA的DNA聚合酶活性:以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA
用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種都可。
實驗方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR
3 質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位,包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?,F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外,還有大量很小的環(huán)狀DNA分子,這就是質(zhì)粒(plasmid)(補(bǔ)充:部分質(zhì)粒為RNA)。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因,例如,四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome),這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體,也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。
目前,已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種,已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小,約為細(xì)菌染色體的0.5%~3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小,大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類:較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上,較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì),可以把質(zhì)粒分為兩類:一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒,當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時,質(zhì)粒也復(fù)制一次,每個細(xì)胞內(nèi)只有1~2個質(zhì)粒;另一類是松弛型質(zhì)粒,當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制,每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān),某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型,而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
在基因工程中,常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體,如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr),并含有5種內(nèi)切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點,不會影響兩個抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點,就會使抗四環(huán)素基因失活。這時,含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素,但對四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素,而沒有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似,只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質(zhì)粒運(yùn)載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。
4 基因診斷(gene diagnosis)是以探測基因的存在,分析基因的類型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常,從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷技術(shù),它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展。
常用基因診斷技術(shù):
一、Southern印跡法(Southern blot)
基本原理是:硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強(qiáng),當(dāng)電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理,覆以上述濾膜,再于其上方壓上多層干燥的吸水紙,借助它對深鹽溶液的上吸作用,凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的,即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后,經(jīng)過80℃烘烤的DNA,將原位地固定于膜上。
當(dāng)含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后,即可與同位素標(biāo)記了的探針進(jìn)行雜交,并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進(jìn)行,袋內(nèi)放置上述雜交濾膜,加入含有變性后探針的雜交溶液后,在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補(bǔ)原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的,例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后,洗去膜上的未組合的探針,將Ⅹ線膠片覆于膜上,在暗盒中日光進(jìn)行放射自顯影。結(jié)合了同位素標(biāo)記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶,基因的缺失或突變則可能導(dǎo)致帶的缺失或位置改變。
二、聚合酶鏈反應(yīng)
近年來,基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破,這主要歸功于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小時內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬至百萬倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過電泳觀察,也可用于進(jìn)一步的分析。這樣,少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察,而通過擴(kuò)增至百萬倍后直接觀察到,而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。
三、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性
小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出,并用于致病基因的連鎖分析,這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP)連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析.
四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時,可以合成等基因特異的寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO)用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針,與正?;蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交,但不能與突變基因序列雜交;另一種與突變基因序列一致,能與突變基因序列穩(wěn)定雜交,但不能與正?;蛐蛄蟹€(wěn)定雜交,這樣,就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.
PCR可結(jié)合ASO,即PCR-ASO技術(shù),即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增,然后再與ASO探針作點雜交,這樣大大簡化了方法,節(jié)約了時間,而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。
五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(signle strand conformation polymorphism,SSCP)是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異,這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同,從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時,通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性,并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳,突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異,從而可據(jù)之作出診斷。
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