茶樹幼根cDNA文庫構(gòu)建及其表達(dá)序列標(biāo)簽特性分析

茶樹幼根cDNA文庫構(gòu)建及其表達(dá)序列標(biāo)簽特性分析

以茶樹龍井43實生苗新生幼根為材料，應(yīng)用pBluescript II XR cDNA Library Construction Kit，構(gòu)建了我國第一個茶樹幼根cDNA文庫。測試結(jié)果表明原始文庫的滴度為1．85×10^7pft/mL，重組率為85．7％，插入片段絕大多數(shù)分布在1．0-1．5kb左右。隨機(jī)挑選5115個克隆進(jìn)行序列測定，去除空載體和插入片段短于150bp的序列后，獲得有效序列4833個，經(jīng)過序列拼接后共獲得3482條表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequencetags，EST），包括901個contigs和2581個singletons。通過與NCBI等非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對、查詢和注釋，獲得已知功能基因或具推測功能的EST共1376個，代表943個茶樹功能基因，421個EST為未知功能基因，1685個EST為新的表達(dá)基因。這些數(shù)據(jù)將為將為我們從分子水平上更好地了解、研究、調(diào)控茶樹的生理代謝、生長發(fā)育和品質(zhì)等提供極有價值的資源。

完成機(jī)構(gòu)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹資源與改良研究中心、國家茶樹改良中心,杭州310008

構(gòu)建基因組文庫的步驟 基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 建立基因組文庫的方法 建立基因組文庫的其他方法 建立cDNA文庫的

構(gòu)建基因組文庫的步驟
A 分離基因組DNA；B 用超聲波或限制酶等進(jìn)行基因組DNA部分或完全降解；C 將降解物進(jìn)行分級得到所需大小DNA片段；D 將DNA片段與載體連接(一般用λ噬菌體載體)；E 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；F 最后篩選鑒定重組子克隆。
建立基因組文庫的方法2—λ噬菌體基因組文庫 可插入較大片段，最大可達(dá)23kb
建立基因組文庫的其他方法：cosmid基因組文庫 YAC基因組文庫 BAC基因組文庫
基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：
重組克隆的總數(shù)不宜過大， 以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量最好大于基因的長度， 避
免基因被分隔克??；克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域, 以利克隆排序；克隆片
段易于從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選
建立cDNA文庫的基本步驟
(1)隔離總RNA和凈化mRNA (2)合成的雙鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸適合插入一個克隆載體(3)克隆cDNA合適的向量(4)轉(zhuǎn)移到合適的宿主細(xì)胞的重組載體(5)篩查陽性克隆
cDNA克隆的策略
(1)自身引導(dǎo)的第二鏈合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改進(jìn)。尾隨第一鏈寡核苷酸（DC）允許使用寡核苷酸引物（ DG）將要開展的第二鏈（3）cDNA的定向克隆
從基因文庫中篩選分離目的基因克隆(1)制備核酸探針進(jìn)行雜交篩選(2) 制備抗體進(jìn)行免疫雜交篩選(3)根據(jù)生物大分子間的相互作用篩選目的基因(4)利用PCR技術(shù)篩選目的基因文庫(5)利用噬菌體表面展示技術(shù)分離目的cDNA克?。菏删w展示(phage display)：是在噬菌體表面表達(dá)已融合到噬菌體外殼蛋白的重組蛋白或多肽的技術(shù)。
應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的關(guān)鍵是構(gòu)建表達(dá)性基因文庫，這種文庫稱為噬菌體展示文庫(phage display library )。
常用的構(gòu)建噬菌體顯示文庫的表達(dá)載體有兩類：絲狀噬菌體和以這些噬菌體復(fù)制起始序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的噬菌粒(phagemid)。
mRNA差別顯示技術(shù)原理：
在 mRNA3′端的 poly (A)5’上游的 2個堿基只有 1 2種組合。與此相對應(yīng)，共可人工合成12種不同的下游引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA 合成cDNA第一條鏈。這種引物通常稱為3’端錨定引物，它由Oligo-d T后面接上兩個堿基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)構(gòu)成。這樣，每一種此類人工合成的寡核苷酸引物，都將能夠把總mRNA群體的1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等的但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。
DDRT-PCR的主要步驟：
Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鏈cDNA；Ⅱ.用5'隨機(jī)引物和某個3'端錨定引物對擴(kuò)增第一鏈(摻入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測差別條帶；Ⅳ.回收特異性差別條帶；Ⅴ.用同一引物對擴(kuò)增已回收的DNA條帶；Ⅵ.用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。
DNA插入誘變法分離目的基因
DNA插入誘變法主要用于植物目的基因的克隆分離研究。其基本原理是，當(dāng)一段特定的DNA序列插入到植物基因的內(nèi)部或其鄰近位置時，一般會誘導(dǎo)該基因發(fā)生突變形成突變體植株，或者在插入位置產(chǎn)生一個新的基因。 如果該DNA插入序列是已知的，便可用它作為DNA分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選得到突變基因片段。然后利用此突變基因片段制備探針，從野生型植株的基因組DNA文庫中克隆出野生型的目的基因。這樣，插入的DNA序列相當(dāng)于在植物基因上貼了一張標(biāo)簽，因此，DNA插入誘變法又叫DNA標(biāo)簽法(DNA tagging)。
差別雜交和減法雜交技術(shù)分離目的基因
差別雜交
構(gòu)建了基因文庫后，如沒有任何可供選擇的探針進(jìn)行篩選，或沒有任何有關(guān)目的基因的核苷酸序列信息時，可以考慮用差別雜交法篩選目的基因片段。差別雜交(Differential hybridization)也稱為差別篩選(Differential screening)法。
特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長因子調(diào)控的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。
差別雜交的技術(shù)原理：有目的基因能正常表達(dá)和不能表達(dá)的兩個不同的細(xì)胞群體。
在這種情況下，分別制備兩種不同細(xì)胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有一定比例的目的基因mRNA ，另一個群體不含有目的基因mRNA。
差別雜交的技術(shù)原理過程：
以這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針，分別對由表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行篩選。
當(dāng)以目的基因表達(dá)的mRNA群體為探針時，所有包含重組體的菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點;
而以目的基因不表達(dá)的mRNA群體為探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點。
比較這兩種底片并對照原平板，變可以挑選出含有目的基因的菌落，供進(jìn)一步研究用。
差別雜交法的局限性：首先，差別雜交的靈敏度比較低，不適合低豐度mRNA的目的基因的分離。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑，是一項十分耗時耗力的工作；第三，差別雜交重復(fù)性差。差別雜交涉及文庫的濾膜影印，不同濾膜之間的DNA保有量往往不均一，雜交所得的信號強(qiáng)度也會不一致，需要重新進(jìn)行點雜交，以做進(jìn)一步的陽性克隆鑒定工作 。
mRNA減法雜交基本原理：從表達(dá)目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后與無目的基因表達(dá)的組織中提取的mRNA做過量雜交，在兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成程cDNA/mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍然保持單鏈狀態(tài)，這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達(dá)的序列。
基因突變技術(shù)分為兩大類：位點特異性突變和隨機(jī)突變。位點特異性突變又分兩種類型：一類是通過寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二類是利用PCR,以雙鏈DNA為模板所進(jìn)行的基因突變。
寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變的原理
使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，啟動單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子鏈的組成部分。因此，所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列。要求所設(shè)計的寡核苷酸引物除了所需的突變位點之外，與目的基因編碼的區(qū)段完全互補(bǔ)。
作為誘變劑的寡核苷酸序列，同待誘變的目的基因的互補(bǔ)序列之間，能形成一種穩(wěn)定的唯一的雙鏈結(jié)構(gòu)。決定雙鏈區(qū)段穩(wěn)定性的主要因素是堿基的組分、核苷酸的錯配以及寡核苷酸引物的長度等。
寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變的基本步驟
(a)將要進(jìn)行突變的目標(biāo)基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌體載體或噬菌粒載體。(b)從重組的M13或噬菌粒中制備單鏈DNA。(c)將設(shè)計好的寡核苷酸突變引物的5’端用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化。(d)將上述突變引物與目標(biāo)基因(單鏈的DNA模板)進(jìn)行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情況下，使退火引物沿單鏈DNA模板延伸，然后新生鏈的末端用T4 DNA連接酶連接。(f)轉(zhuǎn)染易感細(xì)菌。(g)篩選出帶有突變的目標(biāo)基因的噬菌斑。(h)從突變的重組噬菌體制備單鏈DNA，通過DNA序列分析確認(rèn)突變位點的正確性。(i)從重組的M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA中回收突變的目標(biāo)基因(DNA片段)。(j)將突變了的基因(DNA片段)重組入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。
第五章
受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件
(1)便于重組DNA分子的導(dǎo)入。如易形成感受態(tài)，具有較高的轉(zhuǎn)化效率；(2) 能使重組體DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重組體的篩選。如具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀； (4) 受體細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長，能進(jìn)行高密度培養(yǎng)；對動物細(xì)胞要可懸浮培養(yǎng)，對培養(yǎng)基適應(yīng)性要好；(5)安全性高，無治病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染：感染與寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累。尤其是對枯草芽孢桿菌。(7) 受體細(xì)胞的密碼子偏倚性要??；(8) 具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表達(dá)；(9) 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值；(10)對于用于基因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體要用重組整合缺陷型。
第六章
克隆基因高表達(dá)的相關(guān)因素
1有效轉(zhuǎn)錄開始 關(guān)鍵的一步，并限制外源基因表達(dá)的一步！構(gòu)建表達(dá)載體的同時，選擇強(qiáng)的和可控制的啟動子和相關(guān)終止序列。
2有效延長和終止轉(zhuǎn)錄正確 3 mRNA的穩(wěn)定性4有效地轉(zhuǎn)錄開始5遺傳密碼子偏向6核糖核酸處理過程7終止密碼子8表達(dá)載體9重組蛋白
Lac 表達(dá)系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)
具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為：啟動子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）；正調(diào)節(jié)因子 CAP；負(fù)調(diào)節(jié)因子 lac I
Tac 表達(dá)系統(tǒng)
tac啟動子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜合啟動子。
調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于 trp 和 lacUV5啟動子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達(dá)水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。
包涵體蛋白
在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起，形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體(inclusion body, inclusive body)。
包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，并且大部分為外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，它們具有正確的氨基酸序列，但構(gòu)像卻是錯誤的，因而包涵體蛋白一般沒有生物學(xué)活性。
除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。
包涵體形成的原因
主要因為在重組蛋白的表達(dá)過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。此外，還有以下原因：
(1)表達(dá)量過高。(2) 重組蛋白的氨基酸組成(3)重組蛋白所處的環(huán)境：溫度、pH(4)缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類(5)培養(yǎng)條件不佳
酵母基因表達(dá)載體的種類
自主復(fù)制型質(zhì)粒載體:含酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和克隆位點等關(guān)鍵元件。較高拷貝數(shù)，細(xì)胞分裂時不能平均分配到子細(xì)胞中。
整合型質(zhì)粒載體:不含酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)，但含有整合介導(dǎo)區(qū)。
著絲粒型質(zhì)粒載體:在自主復(fù)制型質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件，可保證平均分配到子細(xì)胞中。1-2拷貝/細(xì)胞。
酵母人工染色體:以線性雙鏈DNA形式存在于酵母細(xì)胞，每個細(xì)胞只有單拷貝。

簡要分析基因的表達(dá)系統(tǒng)的組成及優(yōu)化策略。

原核表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)調(diào)控方式 組成型,誘導(dǎo)型 表達(dá)產(chǎn)物定位 分泌型,不分泌型(細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞膜,周質(zhì)空間) 產(chǎn)物純化方式 是否融合蛋白,是否一步親和純化 產(chǎn)物溶解狀況 可溶,包含體,分泌型
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低
為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是
①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制
②能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及；
③能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量
因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

2RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：

1、 依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈

2、 Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA

3、 依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA

用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。

實驗方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR

3 質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)（補(bǔ)充：部分質(zhì)粒為RNA）。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。
目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1～2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質(zhì)粒運(yùn)載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。

4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常，從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷技術(shù)，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展。

常用基因診斷技術(shù)：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強(qiáng)，當(dāng)電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。
當(dāng)含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標(biāo)記了的探針進(jìn)行雜交，并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進(jìn)行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補(bǔ)原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進(jìn)行放射自顯影。結(jié)合了同位素標(biāo)記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導(dǎo)致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應(yīng)

近年來，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬至百萬倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進(jìn)一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴(kuò)增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。

三、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.

PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。

五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。

本文地址:http://www.soujuw.cn/cha/27442.html.

聲明： 我們致力于保護(hù)作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實真實出處，未能及時與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請立即通知我們(管理員郵箱：602607956@qq.com)，情況屬實，我們會第一時間予以刪除，并同時向您表示歉意,謝謝!

上一篇: 茶文化的延續(xù)與蝶變

下一篇: 谷雨茶節(jié),