清華大學(xué)用CRISPR解析重要lncRNA

清華大學(xué)用CRISPR解析重要lncRNA

2016年08月28日訊 國際學(xué)術(shù)期刊《Genome Research》在線刊登了清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的高冠軍博士帶領(lǐng)的一項(xiàng)研究成果，題為“Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis”。這項(xiàng)研究確定了128個(gè)睪丸特異性的果蠅lncRNA，并采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)解析了它們的重要功能。

本文通訊作者高冠軍早年畢業(yè)于揚(yáng)州大學(xué)，2005年博士畢業(yè)于浙江大學(xué)，2006年至2011年在美國國立衛(wèi)生研究院從事博士后和Research Fellow，2011年至今為清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院PI、博士生導(dǎo)師。其帶領(lǐng)的課題組通過運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室在國際上率先建立的CRISPR與phiC31重組酶相結(jié)合的高效果蠅基因打靶系統(tǒng)（knock-out和knock-in），綜合運(yùn)用遺傳與生化相結(jié)合的方法與技術(shù)，規(guī)?；芯咳旧|(zhì)表觀遺傳學(xué)相關(guān)因子（如非編碼RNA及組蛋白修飾等）在生殖系統(tǒng)及胚胎早期發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能及相應(yīng)的分子作用機(jī)制。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是最近發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞RNAs，在許多細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。雖然lncRNAs已在各種系統(tǒng)中進(jìn)行了系統(tǒng)性的鑒定，但是在活體動(dòng)物模型中，它們中的大多數(shù)都沒有得以功能上的表征。在這項(xiàng)研究中，該研究小組確定了128個(gè)睪丸特異性的果蠅lncRNAs，并采用一種優(yōu)化的三組份CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除了它們當(dāng)中的105個(gè)。在lncRNA敲除的突變果蠅中，有33只（31%）表現(xiàn)出部分或全部的雄性生育能力喪失，伴有晚期精子發(fā)生的可見發(fā)育缺陷。

此外，6只敲除果蠅通過一種反式構(gòu)型的轉(zhuǎn)基因而得以完全或部分修復(fù)，從而表明這些lncRNAs主要是反式發(fā)揮作用。此外，5個(gè)lncRNA突變體的基因表達(dá)譜顯示，睪丸特異性lncRNAs調(diào)節(jié)著總體的基因表達(dá)，精心策劃后期的雄性生殖細(xì)胞分化。

與編碼基因相比，睪丸特異性lncRNAs演化得更快。此外，具有更大功能重要性的lncRNAs具有較高的序列保守性，這表明它們處于不斷的進(jìn)化選擇之下?？偟膩碚f，這些研究結(jié)果揭示了迅速進(jìn)化的睪丸特異性lncRNAs在果蠅精子發(fā)生后期的關(guān)鍵功能。

此前，研究人員還公布了lncRNA在多種生物過程中的重要作用。例如，日本理化研究所（RIKEN）RNA生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Shinichi Nakagawa及其同事發(fā)現(xiàn)，一個(gè)特別的長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA），在某些情況下可能對(duì)于生育是至關(guān)重要的。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2015年1月的國際著名期刊《Development》。

長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）正成為各種生物學(xué)過程的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，然而，lncRNA在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中所起的作用，尚不明確。2015年1月20日，美國H. Lee Moffitt癌癥中心和浙江腫瘤醫(yī)院的研究人員，在《Journal of Biological Chemistry》發(fā)表了一項(xiàng)研究成果，解析了lncRNA在乳腺上皮細(xì)胞EMT過程中所起的作用。

2014年12月16日，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、山東大學(xué)、南方醫(yī)科大學(xué)、伯明翰大學(xué)和香港大學(xué)等處的研究人員，在國際著名學(xué)術(shù)期刊《Cell Research》發(fā)表了一項(xiàng)最新研究成果。這項(xiàng)研究對(duì)于lncRNAs在重編程中的作用提供了獨(dú)特見解，并在p53和異染色質(zhì)之間建立了一種新的聯(lián)系。

CRISPR Cas9系統(tǒng)目前的研究熱點(diǎn)在什么方面

1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的成簇的、有規(guī)律的、間隔的短回文重復(fù)序列。07年，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵；08年，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的
CRISPR系統(tǒng)能夠阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系統(tǒng)分為Type I、TypeII 、Type III三種類型。在TypeII
系統(tǒng)中包含一個(gè)標(biāo)志性的Cas9蛋白（參與crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA或外源質(zhì)粒)。CRISPR/Cas系統(tǒng)和Cas9蛋白結(jié)合成復(fù)合
體，發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：

構(gòu)建方便簡(jiǎn)單快捷
高效的介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入和基因組的點(diǎn)突變
精確的切口酶活性提高了基因治療的安全性
缺點(diǎn)：

嚴(yán)重的脫靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸內(nèi)切酶（前兩代分別是ZFN和TALEN），用于復(fù)雜基因組的編輯，目前該技術(shù)應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠及細(xì)菌的基因組精確修飾。
4.CRISPR/Cas9目前熱點(diǎn)
CRISPR/Cas9有個(gè)極大的優(yōu)勢(shì)就是可以改造為切口酶，在DNA的特定位置制造單鏈切口，這樣不會(huì)引起非同源末端連接，但是可以激活同源細(xì)胞的重組。
這套系統(tǒng)目前的主要用途是在以下幾個(gè)方面：

基因定點(diǎn)InDel突變
基因定點(diǎn)敲入
兩位點(diǎn)同時(shí)突變
小片段的缺失
編碼基因和非編碼基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除

反義rna抑制基因表達(dá)的作用體現(xiàn)在那四個(gè)方面

反義lncRNA（antisense lncRNA）是指由基因（通常是蛋白編碼基因）的反義鏈轉(zhuǎn)錄，并與該基因的mRNA存在序列重疊的RNA分子。隨著對(duì)非編碼RNA研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)約70%的基因均有反義lncRNA【1】。更為重要的是，反義lncRNA往往與其正義鏈基因的表達(dá)存在相關(guān)性，提示反義lncRNA可能廣泛地參與了蛋白編碼基因的表達(dá)調(diào)控。

目前，關(guān)于反義lncRNA影響正義鏈基因表達(dá)的作用機(jī)制，主要有3類：1.反義lncRNA的轉(zhuǎn)錄過程，抑制正義鏈基因的轉(zhuǎn)錄，該機(jī)制認(rèn)為反義鏈轉(zhuǎn)錄事件本身，而不是反義lncRNA，調(diào)控了基因的表達(dá)。2.反義lncRNA結(jié)合DNA或組蛋白修飾酶，調(diào)控所在基因座位的表觀遺傳學(xué)，從而影響正義鏈基因的表達(dá)。3.反義lncRNA與正義鏈mRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，影響mRNA的可變剪接等【2】。

2019年4月4日，來自美國哥倫比亞大學(xué)的Tom Maniatis教授在 Cell 上發(fā)表研究Antisense lncRNA Transcription Mediates DNA Demethylation to Drive Stochastic Protocadherin a Promoter Choice。該研究首次發(fā)現(xiàn)反義lncRNA的轉(zhuǎn)錄可以影響DNA甲基化，進(jìn)而改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，促進(jìn)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的結(jié)合，調(diào)控Pcdhα基因的表達(dá)。該反義lncRNA的作用模型也解釋了Pcdhα基因的可變外顯子選擇機(jī)制。

在神經(jīng)發(fā)育過程中，單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞響應(yīng)不同的信號(hào)分子，會(huì)分化為具有不同功能的細(xì)胞，并最終形成復(fù)雜的神經(jīng)回路。在此過程中，神經(jīng)細(xì)胞需要區(qū)別自身與其他神經(jīng)元，這就需要一個(gè)細(xì)胞表面獨(dú)特的識(shí)別蛋白。哺乳動(dòng)物的Pcdh（Protocadherin，原鈣黏附蛋白）就發(fā)揮了這樣的功能，它具有多個(gè)隨機(jī)啟動(dòng)的可變外顯子，可產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本（isoform）（圖1）。

圖1. Pcdhα基因
為了研究Pcdhα基因的表達(dá)調(diào)控，研究者系統(tǒng)地分析了該基因座位的轉(zhuǎn)錄情況，驚訝的發(fā)現(xiàn)每一個(gè)Pcdhα可變外顯子的反義鏈，都存在一個(gè)保守的反義lncRNA。利用CRISPR dCas9-VPR系統(tǒng)激活反義lncRNA的表達(dá)，會(huì)促進(jìn)相應(yīng)可變外顯子的轉(zhuǎn)錄。

那么反義lncRNA是如何促進(jìn)響應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄的呢？研究者發(fā)現(xiàn)，反義lncRNA的轉(zhuǎn)錄，會(huì)造成該位點(diǎn)DNA去甲基化的發(fā)生，從而使遠(yuǎn)端增強(qiáng)子靠近該外顯子的啟動(dòng)子，促進(jìn)它的表達(dá)。如圖2所示，Pcdhα基因座位均帶有抑制表達(dá)的DNA甲基化修飾，而當(dāng)反義lncRNA表達(dá)時(shí)，該外顯子附近的DNA被DNA去甲基化酶TET3識(shí)別，去除了甲基化修飾，cohesin蛋白重塑了染色體的結(jié)構(gòu)，HS5-1增強(qiáng)子與該基因座位的啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)Pcdhα變體的表達(dá)。

圖2
該研究從非編碼RNA的角度揭示了Pcdhα基因變體的隨機(jī)選擇機(jī)制，然而，目前對(duì)反義lncRNA的表達(dá)驅(qū)動(dòng)尚不清楚。對(duì)該問題的解決將有助于更全面的了解神經(jīng)細(xì)胞身份的決定過程。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.008

制版人：珂

參考文獻(xiàn)

1. Yiping He, Bert Vogelstein, Victor E. Velculescu，The Antisense Transcriptomes of Human Cells，SCIENCE VOL 322 19 DECEMBER 2008

2. Mohammad Ali Faghihi and Claes Wahlestedt，Regulatory roles of natural antisense transcripts.NATURE REVIEWS, VOlUME 10 | SEpTEMBER 2009 | 637

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/302249.html.

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