南開大學:“自殺式”CRISPR/Cas9系統(tǒng)

2016年08月28日訊 來自南開大學和北京師范大學的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表題為“A ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system to promote gene deletion and restoration by electroporation in Cryptococcus neoformans”的研究論文。這項研究提出了一種“自殺式” CRISPR-Cas9系統(tǒng)，使我們能夠通過后續(xù)的互補作用，驗證基因的功能，并有可能減少脫靶效應。因此，這項技術適用于新型隱球菌的功能基因組學研究。

作為原核生物的一種適應性免疫機制，集群定期間隔短回文重復（CRISPR）和CRISPR相關（CRISPER-Cas）系統(tǒng)，使宿主能夠防御噬菌體和其他可移動的元素和載體。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組編輯中的效力廣受好評，特別是難以進行遺傳操縱的生物體。為了構建這一系統(tǒng)，需要兩個基本組成部分：一個單一的嵌合引導性RNA（gRNA）成分，是通過將約20nt的靶序列RNA（crRNA）與一段訂制的細菌tracrRNA、以及細菌Cas9內切酶的一個蛋白質成分融合而產(chǎn)生的。

這一系統(tǒng)通常被轉化到宿主細胞以進行功能表達。用以gRNA和Cas9核酸酶生產(chǎn)的表達組件將在很大程度上持續(xù)存在于宿主中--甚至在編輯過程完成后，作為異位整合副本或自由復制的DNA分子（minichromosomes）。因此，這種方法有其固有的缺陷，如Cas9內切酶的潛在毒性和伴隨細胞增殖而積累的靶基因突變。觸發(fā)不良遺傳學變化的CRISPR-Cas9系統(tǒng)通常出現(xiàn)脫靶效用，在某些生物中CRISPR-Cas9是有細胞毒性的，包括釀酒酵母和裂殖酵母。

科學家在研究中遇到的另一個實際問題是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在細胞中的持久性，會阻止新生隱球菌（C. neoformans）中突變基因的修復，因為該系統(tǒng)也靶定包含相同gRNA靶序列的互補基因。這種局限性代表了一個重要的問題，在編輯系統(tǒng)的實際應用中必須解決，因為CRISPR-Cas9表達組件的體內存在，并不適于許多的應用（例如，生物醫(yī)學和農業(yè)）。即使是在微生物的實驗室研究中，剩余的CRISPR-Cas9 DNA也會降低該系統(tǒng)作為基因組操縱工具的有利度。

擔子菌酵母新型隱球菌（C. neoformans）作為艾滋病相關真菌病和其他基本生物問題的一種模型，已經(jīng)得以廣泛的研究，并存在低的同源重組頻率，特別是D型菌株。目前已經(jīng)開發(fā)出來兩種不同的轉化系統(tǒng)--基因槍轉化和電穿孔轉化，通過同源重組破壞許多基因。然而，這些方法實現(xiàn)的同源重組頻率，在A型和D型菌株之間有著顯著的差異?；驑屴D化是一種昂貴的程序，可以通過同源重組實現(xiàn)A型菌株的基因破壞，頻率在2%和50%之間，而D型菌株系列的頻率在1%和4%之間。

此外，在D型菌株中，電穿孔轉化可引起1/1000到1/100,000的同源重組頻率。其他基因組編輯技術，例如鋅指核酸酶或TAL效應物核酸酶（TALENS），在這種菌一直沒有相關報道。因此，構建一個功能性CRISPR-Cas9系統(tǒng)來進行靶向基因刪除和基因重組，用于酵母的毒性研究，有著重要的意義。

在這項研究中，研究人員報道了一種自發(fā)消除CRISPR-Cas9系統(tǒng)的方法，而不會影響其強大的編輯功能。該研究小組在一種內源性U6啟動子和人密碼子優(yōu)化的Cas9內切酶的驅動下，成功地表達了單個引導RNA。該系統(tǒng)可在酵母中有效地生成一個插入缺失突變，并通過電穿孔法，經(jīng)由同源同源性修復，有效地進行靶向基因中斷。

然后，該研究小組通過CRISPR-Cas9表達組件到重組構建的順式排列，證明了該系統(tǒng)的自發(fā)消除。在系統(tǒng)介導的雙交換之后，CRISPR-Cas9組件被裂解和降解，這可通過Southern blotting得以驗證。這種“自殺式” CRISPR-Cas9系統(tǒng)，使我們能夠通過后續(xù)的互補作用，來驗證基因的功能，并有可能減少脫靶效應。因此，這項技術有潛力用于新型隱球菌的功能基因組學研究。

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