Cell新突破：基因“暗物質(zhì)”的另一層功能(有沒有關(guān)于基因敲除的論文啊)

Cell新突破：基因“暗物質(zhì)”的另一層功能

2016年10月07日訊 約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員通過解析一種罕見復(fù)雜的多基因疾病：Hirschsprung癥，發(fā)現(xiàn)了更深層次的遺傳機制，即這種疾病的患者是由于體內(nèi)某個特殊基因的基因調(diào)控序列發(fā)生了多個突變，也就是說這些突變破壞了整個基因網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同功能。

這一研究成果公布在9月29日Cell雜志在線版上。領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是約翰霍普金斯大學(xué)McKusick-Nathans遺傳醫(yī)學(xué)研究所教授Aravinda Chakravarti，他開創(chuàng)了所謂多基因復(fù)雜疾病研究的先河。

Chakravarti表示，“我們認為基因都是各過各的，但實際上它們不可能是單獨存活。相反大家族中多個基因與調(diào)控元件都生活在同一條染色體上，不斷的發(fā)生相互作用，每一個都有其自己的工作，但是都需要協(xié)同作用，完成一項基因功能，如果其中一個受到干擾，其它的也無法置身事外?！?/p>

Chakravarti很早就開始研究Hirschsprung癥，這是一種先天性的紊亂，由于部分結(jié)腸缺乏神經(jīng)細胞，因此無法放松，導(dǎo)致的結(jié)果就慢性便秘，腹部膨脹，在美國每5000個新生兒中就有一個受這種紊亂影響，但可以通過外科手術(shù)來治療。雖然這種疾病有復(fù)雜的遺傳成因，但它只有一個器官：結(jié)腸出現(xiàn)癥狀，因此是研究復(fù)雜遺傳疾病的優(yōu)秀模型。

在2002年和2015年，Chakravarti研究組分別通過全基因組關(guān)聯(lián)研究 （GWAS） ，找到了與這一疾病相關(guān)的遺傳突變，進一步的研究還確定了RET基因及其調(diào)控元件的重要影響--幾乎每位Hirschsprung癥患者都至少有一個RET相關(guān)突變。但是由于許多非Hirschsprung癥患者也有這個突變，因此病理原因仍然是一個謎。

研究組成員決定試試分析 RET 基因附近特殊區(qū)域中的遺傳代碼SNP，這些所謂的基因增強子就像是開關(guān)，能通過結(jié)合合適的定位蛋白（轉(zhuǎn)錄因子），開啟或關(guān)閉基因活性。

之后研究人員將RET基因換成了一個報告基因，在人類神經(jīng)細胞系中進行了一系列的實驗，發(fā)現(xiàn)只有三個SNPs在不同的增強子作用下，才能弱化增強子上結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的作用，減少基因活性。

研究人員檢驗了這三個SNPs的不同組合，結(jié)果表明雖然沒有一個增強子能直接相互作用，但他們總結(jié)出了一個趨勢：越多增強子受到影響，報告基因活性就越低。在這之后，研究人員又將實驗擴展到了346位Hirschsprung癥患者，和732位健康對照，從而確定了這一規(guī)律。出現(xiàn)這三個SNPs的人群具有Hirschsprung癥四倍的患病風(fēng)險。

進一步的小鼠實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)這三個增強子是在發(fā)育胚胎腸道的不同發(fā)育時期發(fā)揮作用的，他們也找到了與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。由此研究人員在小鼠中剔除了RET基因，檢測其“基因家族”如何做出回應(yīng)。結(jié)果三個與增強子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子中有兩個，在RET被沉默后活性降低，但在細胞表面與RET共同作用的蛋白，以及與RET結(jié)合的信號分子活性增加了，這些來自人體細胞的數(shù)據(jù)也表明降低轉(zhuǎn)錄因子的水平會減少RET的表達水平。

文章的第一作者Sumantra Chatterjee博士指出，“這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋RET相關(guān)的突變?yōu)楹问荋irschsprung癥的必需非充要條件。”

Chakravarti說，“我們證明了這些基因彼此關(guān)系密切，這不是因為它們序列或基因組位置相似，而是因為它們共同作用，執(zhí)行一項功能?！?/p>

有沒有關(guān)于基因敲除的論文啊

基因敲除在腎素-血管緊張素系統(tǒng)研究中的應(yīng)用
關(guān)鍵詞： 基因 腎素-血管緊張素系統(tǒng) 高血壓

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RASA）在維持正常血壓和電解質(zhì)平衡中起著十分重要的作用[1]，也是高血壓防治研究的中心環(huán)節(jié)[2]。80年代以來對RAS的研究已深入到基因和分子水平，如RAS基因多態(tài)性與高血壓發(fā)病的研究等[3]。近年來應(yīng)用基因打靶（gene targeting）則為 RAS研究提供了一個全新的手段，本文著重介紹其中的基因敲除（gene kockout）在這方面的應(yīng)用。
1基因敲除的基本原理和步驟
1.1 基本原理
基因敲除是利用基因同源重組（gene homologous recombination）又稱基因打靶的原理，用外源片斷整合到活體細胞DNA的同源序列中，使某個基因被取代或破壞而失活，由于同源重組具有高度特異性和方向性，外源片斷也具有可操作性，故該技術(shù)可使細胞的基因定點和定量改變[4,5]。
1.2 基本步驟
為了改變某個動物的基因型且能穩(wěn)定遺傳，科學(xué)家們經(jīng)過長期探索建立了將胚胎干細胞（embryo stem cell ESC）基因打靶及胚胎移植結(jié)合起來的一套新技術(shù)[6，7]。ESC取自小鼠胚泡的內(nèi)細胞層細胞，具有能在體外培養(yǎng)保存又能在一定條件下發(fā)育成個體的性能。在體外進行基因操作后植回小鼠胚泡發(fā)育成嵌合體。嵌合體是含有突變基因的性腺細胞，通過雜交便獲得突變基因的純合子和雜合子。基因敲除過程：先克隆ESC靶基因的同源片斷。用限制性內(nèi)切酶切開其外顯子兩端，插入一個標志/選擇基因（常用Neo-新霉磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，作為陽性選擇基因和陽性同源重組的標志），另在載體同源序列外圍接上另一個陰性選擇基因（常用單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因，作為非同源重組的標志和篩選基因）。將載體導(dǎo)入ESC，用含G418/GANC的培養(yǎng)液作正負選擇系統(tǒng)PNS）篩選出已發(fā)生同源重組的ESC，將后者植入另一懷孕小鼠的胚泡后發(fā)育娩出嵌合體小鼠。用Southem雜交來鑒定已攜帶敲除基因（即含Neo基因）的雄鼠，再用后者與同系雌鼠交配娩出基因敲除的雜合子即F1，F(xiàn)1近交便產(chǎn)生基因敲除的純合子和雜合子（F2），經(jīng)多次交配繁殖出數(shù)量眾多的新品系小鼠且保持基因性狀穩(wěn)定遺傳和供研究之用。
2 RAS基因敲除近況
rAS基因敲除只是近幾年才出現(xiàn)的方法，但它極大促進了人們對RAS的認識。
2.1 血管緊張原基因敲除
tanimotok等[8]用基因敲除術(shù)建立了血管緊張素原（Agt）基因失活的純合子和雜合子小鼠，并進行了一系列的研究，15個雜合子有4個幼鼠死亡，但成年鼠與純合子和野生型小鼠的行為和主要臟器解剖學(xué)均無差異。純合子血漿Agt和血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）為陰性，雜合子為野生型42%，但純合子腎組織mRNA表達增高6～8倍。與此同時純合子鼠血壓與野生型和雜合子相比，SBP、DBP和MAP分別下降33.5mmHg、14.3mmHg、20.8mmHg，而雜合子與野生型鼠的血壓并無差別。為進一步研究Agt基因與血壓之間的關(guān)系，Smithies等[9]通過精心設(shè)計的基因打靶（gap-repair gene targeting）培養(yǎng)出含不同野生型 Agt基因拷貝數(shù)量的小鼠（分別含有0～4個拷貝）。結(jié)果Agt基因缺失型小鼠、幼鼠大部分死亡，少數(shù)成活的成年鼠卻有腎小球小動脈壁增厚，腎皮質(zhì)變薄和腎小球萎縮，但繁殖力正常。含1～4個Agt基因小鼠生長發(fā)育及腎組織結(jié)構(gòu)正常無異，最明顯的變化是隨著基因拷貝增多，血中Agt水平幾乎呈線性水平增高，從35%（單拷貝）到124%（3拷貝）和145%（4拷貝），同時血壓升高程度達到8mmHg/每拷貝，該模型說明了Agt基因與血壓水平之間的數(shù)量依存關(guān)系。最近該作者又將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因打靶結(jié)合起來，將含人腎素和Agt基因的小鼠與Agt缺失型小鼠交配，使后者重新攜帶人腎素及Agt基因，結(jié)果糾正了純合子的低生存率及腎病變，同時血壓升至正常。該模型表明，Agt對小鼠特別是腎的生長發(fā)育非常重要，且人類Agt基因也能取代小鼠Agt基因的功能[10,11]。
2.2 血管緊張素Ⅱ受體基因敲除
血管緊張素Ⅱ（AgtⅡ）受體目前分為Ⅰ型（AT1）和Ⅱ型（AT2），AgtⅡ主要通過AT1起作用。AT1又可細分為AT1a和 aT1b兩個亞型，它們高度同源但組織分布不同，由于缺乏有效的方法來分別兩者生理分工[12]，Masaki等[13]用基因敲除培養(yǎng)出缺乏AT1a受體基因小鼠純合子和雜合子與野生型相比，兩種基因型小鼠的生長發(fā)育及心、腦、腎、血管組織結(jié)構(gòu)正常，腎組織Ang-AT1受體結(jié)合為陰性，雜合子為野生型50%，雜合子及純合子基礎(chǔ)血壓分別比野生型降低了12mmHg和24mmHg。他們還觀察到幾種基因型對 angⅡ反應(yīng)，純合子幾無反應(yīng)，雜合子升壓幅度低且血壓回降速度快，結(jié)果證明AT1a是AngⅡ調(diào)控血壓所必需的。Taskeshi等[14]建立的小鼠已證實了上述結(jié)論，且發(fā)現(xiàn)純合子腎組織mRNA和血中腎素水平明顯升高，他們還進一步研究了該模型小鼠腎小球AT1a分布及對AngⅡ（激動劑）和CV-11974（拮抗劑）作用，證實 aT1a分布主要入球、出球小動脈和系膜細胞，AngⅡ主要通過AT1a起作用[15]。Lutz等[16]培養(yǎng)出AT2受體基因缺失型雜合子和純合子小鼠，兩者幼鼠成活率相同，重要臟器結(jié)構(gòu)均正常，基礎(chǔ)血壓也無改變，僅純合子小鼠對AngⅡ反應(yīng)超常及對脫水試驗反應(yīng)遲鈍，主動活動減少，作者認為AT2對生長發(fā)育并不重要但參與RAS系統(tǒng)的心血管功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。但Lchiki等[17]建立的同樣模型卻發(fā)現(xiàn)突變型小鼠基礎(chǔ)血壓比野生型高，作者還進行了系列藥理試驗，給野生型和缺失型小鼠以AngⅡ、losartan、captopril，結(jié)果AngⅡ升壓作用在缺失型強于野生型，lostartan降壓作用也是如此，但 captopril效果兩組之間相同，作者認為在AT2功能上有直接對抗AT1作用。對于兩種AT2基因缺失型小鼠血壓變化不同的現(xiàn)象，Lutz認為與小鼠品種稍有不同而遺傳背景相差有關(guān)。
2.3 ACE基因敲除
業(yè)已證明，ACE基因編碼體細胞型和睪丸型兩種同功酶，但后者功能仍不清楚，為了研究它們在血壓調(diào)控和生育調(diào)控方面的作用，Krege等[18]用插入法敲除了ACE基因中對兩種ACE編碼必需的第14個外顯子。結(jié)果表明雜合子和純合子幼鼠成活率降低，雌鼠繁殖能力正常而雄鼠下降，兩種基因型鼠腎臟發(fā)生退行性改變，值得注意的是盡管雌雄鼠兩種純合子和雜合子血ACE活性減低，但僅雄鼠的血壓下降15～20mmHg。作者認為，ACE對腎臟發(fā)育是必需的，在調(diào)節(jié)血壓方面存在性別差異，人類是否有這種情況需進一步研究[19]。此后該作者又用所謂雙基因打靶術(shù)（double gene targeting）培養(yǎng)出含1、2、3、4個功能性ACE基因的小鼠，結(jié)果隨著基因數(shù)量增加，心臟重量亦增加，腎臟mRNA表達增強，但血壓始終末見有差別。作者認為，ACE活性變化只有足以超過體內(nèi)平衡機制方會導(dǎo)致血壓改變[20]。最近Charles等[21]用基因敲除培養(yǎng)出ACE基因突變小鼠。后者ACE基因不能編碼含羧基末端氨基酸殘基的ACE肽鏈。結(jié)果小鼠血漿ACE活性雖然很高，但組織細胞中卻未測到ACE結(jié)合。同時伴低血壓、腎臟病變和尿濃縮功能損害，其表型與完全缺乏ACE基因小鼠相同，證明ACE羥基末端含有膜結(jié)合點，如果缺乏則ACE只能全部釋放出細胞而不能發(fā)揮對組織結(jié)合和調(diào)節(jié)功能。
2．4 腎素基因敲除
腎素是RAS中的限速酶，Mattew等[22]建立了缺失腎素基因-2（Ren-2）的小鼠，結(jié)果小鼠外觀和組織學(xué)檢查均未見異常，血壓亦無變化，只是血漿腎素活性高于野生型。但該小鼠是含兩個腎素基因（Ren-1和Ren-2）的為數(shù)不多的動物之一，作者認為正常機體發(fā)揮作用主要靠Ren-1基因。
3 展望
利用同源重組技術(shù)建立新的動物模型是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)中具有里程碑意義的突破。人們可以在此基礎(chǔ)上更多、更快、更準確地培養(yǎng)出基因缺失、基因突變、轉(zhuǎn)基因動物對基因表達及調(diào)控和其功能進行細致的研究。過去由于方法限制，對高血壓相關(guān)基因研究難于突破，而利用該項技術(shù)可以定點定量研究有關(guān)基因?qū)π难芙Y(jié)構(gòu)和功能的影響，從而為研究高血壓的發(fā)病機制和防治開辟了廣闊深入的途徑。
參考文獻
1 kathy K et al.Circulation,1993；87:1816～828
2 laragh JH.Kidney int,1993；44:1163～1175
3 lifton RP.Proc Natl acad Sci USA,1995；92:8545～8551
4 Capeechi RP .Scientifie america,1994；270(3):34～38
5 Becker KD et al.Hypertension,1996;27:499～501
6 evans MJ.Nature,1981;292:154～156
7 te Riele H et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992；89:5138～5132
8 tANIMOTOK SF et al.J biol Chem,1994;269:31334～31337
9 smithies O et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;91:3612～3615
10 Robin d et al.J Clin Invest,1997;99:1258～1264
11 Kim hS et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:2735～2739
12 Theodoree O et al.N Engl J Med,1996;334:1649～1655
13 Masaki I et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:3521～3525
14 Taskeshi S et al.J Biol Chem,1995;270(32):18719～18722
15 Kenjiro K et al.Kidney Int,1997;52:S201～S204
16 Lutz h et al.Nature,1995;377(26):744～747
17 Lchiki T et al.Nature,1995;377:748～750
18 Krege jH et al.Nature,1995;375;146～148
19 Hilgers KF et al.Hypertension,1997;29:216～221
20 Krege jH et al.Hypertension,1997;29:150～157
21 Charles R E et al.J Clin Invest,1997;99:2375～2385
22 Mattew GF et al.Hypertension,1996;28:1126～1131

Nature | 腫瘤治療新突破點——類先天性殺傷型T細胞

腫瘤免疫監(jiān)視的概念歸因于細胞免疫在消除轉(zhuǎn)化細胞方面的作用。傳統(tǒng)的CD8+細胞毒性T細胞是這種作用的主要中介，但它們也會轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苁д{(diào)的衰竭狀態(tài)，其特征是表達抑制性受體，如程序性死亡-1 (PD-1)。盡管抗PD-1治療在恢復(fù)癌癥免疫方面取得了臨床成功，但也有許多患者對這種治療沒有反應(yīng)，因此有必要研究癌癥免疫監(jiān)測的替代機制。

4月20日，美國紀念斯隆凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的李明教授及其研究團隊在Nature上發(fā)表了題為“Programme of self-reactive innate-like T cell-mediated cancer immunity”的研究， 揭示了在腫瘤組織內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種具有強大抗腫瘤能力的新型免疫細胞，為無法受惠于現(xiàn)行免疫療法的癌癥病患提供了新希望。

在對小鼠和人類惡性腫瘤T細胞的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了一類αβ T細胞受體(TCR)陽性，表達FCER1G，具有高細胞毒性潛能的 類先天性殺傷型T細胞(ILTCKs)。 這些細胞能夠識別未突變的自身抗原，產(chǎn)生于早期遇到同源抗原后的不同胸腺祖細胞，并在腫瘤進展期間不斷地由胸腺祖細胞補充。值得注意的是，腫瘤內(nèi)ILTCKs的擴張和效應(yīng)分化依賴于癌細胞中白細胞介素-15 (IL-15)的表達，在ILTCK前體細胞中IL-15信號的誘導(dǎo)激活抑制了腫瘤的生長。因此，抗原受體的自我反應(yīng)性、獨特的個體發(fā)生和獨特的癌細胞感應(yīng)機制將ILTCKs與傳統(tǒng)的細胞毒性T細胞區(qū)分開來，并定義了一類新的腫瘤引發(fā)的免疫反應(yīng)。

ILTCKs具有獨特的轉(zhuǎn)錄組

為了研究腫瘤浸潤T細胞之間的異質(zhì)性，對MMTV-PyMT (PyMT)小鼠乳腺腫瘤組織中的CD45+TCRβ+CD8α+細胞進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析，結(jié)果顯示有五個不同的簇。PyMT小鼠腫瘤浸潤CD8α+ T細胞表現(xiàn)出不同的分化和增殖狀態(tài)，其中簇3（C3）代表最新鑒定的αβ TCR家族ILTCKs (αβILTCKs)。分化軌跡推斷表明αβILTCKs分化程序代表了一種進化保守的腫瘤引發(fā)的免疫反應(yīng)。

ILTCKs TCRs能夠識別未突變的腫瘤抗原

NK1.1+ CD8α+?αβILTCKs細胞與傳統(tǒng)的PD-1+ CD8α+ T細胞不是同一個來源。與PD-1+ T細胞相比，NK1.1+?αβILTCKs細胞來源的TCR能夠識別來自多個小鼠的癌細胞共有的未突變抗原。但在缺乏MHC-I（主要組織相容性復(fù)合體）分子的癌細胞中，這種抗原反應(yīng)也隨之消失。αβILTCKs細胞的TCR能夠識別特定的肽- MHC-I復(fù)合體，而不是MHC-I分子本身。

ILTCKs的選擇具有競爭性

傳統(tǒng)的CD8+ T細胞應(yīng)答需要依賴于BATF3和IRF8的傳統(tǒng)1型樹突狀細胞(cDC1s)的啟動，而腫瘤內(nèi)NK1.1+?αβILTCKs應(yīng)答不依賴于cDC1s。這些發(fā)現(xiàn)表明，在次級淋巴器官中，αβILTCKs獨立于樹突狀細胞介導(dǎo)的啟動，并與傳統(tǒng)的CD8+ T細胞不同。事實上，在腫瘤中，發(fā)展表達αβILTCKs來源TCR的胸腺細胞始終和特異地生成NK1.1+?αβILTCKs，而不是PD-1+ T細胞。因此，NK1.1+?αβILTCKs和PD-1+ T細胞代表了兩種相互排斥的細胞命運選擇。強烈的自身反應(yīng)性驅(qū)動αβILTCKs譜系定型，類似于指定不變自然殺傷T細胞(iNKT)和腸上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)命運的“激動劑”選擇過程。αβILTCKs的激動劑選擇信號由對輻射敏感的造血細胞和抗輻射的基質(zhì)細胞調(diào)控。

FCER1G的表達標志著ILTCKs譜系

為了進一步了解ILTCKs譜系的特異性，比較了腫瘤浸潤NK1.1+?αβILTCKs和PD-1+ T細胞及其各自胸腺祖細胞的基因表達譜。編碼NK受體和信號分子的基因在αβILTCKs前體細胞中上調(diào)，并在成熟的NK1.1+?αβILTCKs中保持高表達。NK1.1標記激活的αβILTCKs，但可能不能識別腫瘤中所有的αβILTCKs細胞系。FCER1G則是一個保守的αβILTCKs譜系定義標記，F(xiàn)CER1G的表達充分識別了浸潤腫瘤的αβILTCKs，且不考慮其是否是激活狀態(tài)。

ILTCKs可用于癌癥治療

NK1.1+?αβILTCKs嚴重依賴促炎細胞因子IL-15，在缺乏IL-15的小鼠中幾乎完全沒有FCER1G+胸腺αβILTCKs祖細胞。由于IL-15在淋巴組織和非淋巴組織中均有表達，驅(qū)動腫瘤內(nèi)αβILTCKs擴增和激活的IL-15的確切來源仍然未知。但是，ILTCKs感知癌細胞衍生的IL-15這一點可用于癌癥免疫監(jiān)視。αβILTCKs中的IL-15信號軸可以成為開發(fā)癌癥療法的強大且可利用的底物。

這項研究表明，早期遇到自身抗原可能會永久性地抑制αβILTCKs譜系中的TCR信號傳導(dǎo)，但TCR在αβILTCKs中的后選擇作用仍有待確定。研究強調(diào)了基于αβILTCKs的過繼細胞轉(zhuǎn)移療法的優(yōu)勢，因為這種方法不需要特定靶抗原的認知。因此，針對ILTCKs的策略可能對具有低突變負擔(dān)或?qū)D-1阻斷方式無效的腫瘤特別有效。

本文地址:http://www.soujuw.cn/jiankang/294684.html.

聲明： 我們致力于保護作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實真實出處，未能及時與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請立即通知我們(管理員郵箱：602607956@qq.com)，情況屬實，我們會第一時間予以刪除，并同時向您表示歉意,謝謝!

上一篇: PNAS：用維生素抹去表觀遺傳學(xué)記憶

下一篇: 董欣年院士Nature子刊發(fā)表重要免···