RAPD分子標(biāo)記及其在油茶遺傳育種研究中的應(yīng)用（綜述）

RAPD分子標(biāo)記及其在油茶遺傳育種研究中的應(yīng)用（綜述）

完成機(jī)構(gòu)：中南林業(yè)科技大學(xué)國(guó)家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙410004

王世偉的主要研究成果

1.Shi-Wei Wang，Min Wang．Breeding of NHase hyper-producing Rhodococcus ruber strain LUV30-06 and Verification of mutants by RAPD．The　6th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE2012)，Shanghai，China. (2012) 4：486-490．（EI）
2.Shiwei Wang，Qinghui Wang，Ying Zhai1，Min Wang．Screening of NHase high-producing Rhodococcus ruber Strain TQD-58 by Both Parents Inactivated Protoplast Fusion．2012 International Symposium on Information Technology in Medicine and Education(ITME2012), Hokkaido，Japan.(2012)：737-740 (EI)．
3.Shiwei Wang，Yujie Dai，Jianxin Wang，Yanbing Shen，Heng Zheng，Min Wang．Title: Molecular insights into substrate specificity of Rhodococcus ruber CGMCC3090 by Gene Cloning and Homology Modeling．Enzyme and Microbial Technology (accepted，SCI)．
4.王世偉;王敏.腈類物降解菌多樣性和產(chǎn)腈水合酶研究進(jìn)展,中國(guó)生物工程雜志,2011,31(9):117-123
5. 王世偉，楊曉杰，王中革，楊小花，李旭業(yè)，馮檸，RAPD分子標(biāo)記對(duì)高粱DNA經(jīng)花粉管導(dǎo)入玉米自交系的驗(yàn)證，齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2011，27（1）：54-60
6.劉軍,王世偉,趙凱,周東坡,白蟻的生物防治現(xiàn)狀與研究進(jìn)展, 微生物學(xué)雜志,2010 (2):91-94
7. 王世偉，姜麗娟，李旭業(yè)，外源DNA經(jīng)花粉管通道法導(dǎo)入玉米及后代分子驗(yàn)證研究進(jìn)展，高師理科學(xué)刊，2010，30（2）：76-80
8.王世偉，李旭業(yè)，張偉偉.優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞制備方法提高轉(zhuǎn)化效率的研究.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，25（2）:86-90
9.王世偉，張偉偉，劉軍等.基因與細(xì)胞工程大實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系的建立與實(shí)踐.高師理科學(xué)刊，2008（5）:118-120
10.王世偉，馬璽，平文祥等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇研究進(jìn)展.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（3）:561-565
11.王世偉，董原，李鐵等.一種適合抗癌藥紫杉醇產(chǎn)生菌AFLP分析的DNA提取方法.高師理科學(xué)刊. 2006，26（1）:561-565
12．王世偉，王福全，馬璽等.杉醇產(chǎn)生菌及其工程菌株之間的AFLP遺傳差異分析.生物技術(shù). 2004，15（3）:15-17
13．齊小輝，馬璽，趙凱，王世偉等.線粒體DNA及其應(yīng)用. 生物技術(shù)通訊. 2004，14（5）413-415
14．馬玉超，趙凱，王世偉等.產(chǎn)紫杉醇(Taxo1)內(nèi)生真菌的生物多樣性.菌物研究. 2003，1（1）: 28-32
15．張鵬，王世偉，解玉紅等.紫杉醇產(chǎn)生菌的細(xì)胞總核酸提取. 生物技術(shù). 2003，13（2）:21-23
16．王世偉，齊小輝，劉軍等. (2003) AFLP技術(shù)在微生物分類鑒定、基因標(biāo)定及遺傳多樣性方面的應(yīng)用. 生物技術(shù).13（5）:42-43

遺傳作圖的DNA分子標(biāo)記

DNA 分子標(biāo)記大多是以DNA片段電泳譜帶形式表現(xiàn)的。依其遺傳特性可分為顯性和共顯性標(biāo)記2種；依多態(tài)性檢測(cè)手段可分為以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記和以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記；根據(jù)在基因組中出現(xiàn)的頻率，又可分為低拷貝序列和重復(fù)序列標(biāo)記。
限制性片段多態(tài)性
RFILP是第—種用于研究的DNA標(biāo)記。限制性核酸內(nèi)切酶是一種在特定序列上切割DNA分子的酶，用它處理一個(gè)DNA分子時(shí)，即產(chǎn)生限制片段。這種序列特異性意味著用一種限制酶處理一種DNA分子總會(huì)產(chǎn)生同樣的片段。但對(duì)于基因組DNA來(lái)說(shuō)，并不總是這樣。這是因?yàn)橛行┫拗莆稽c(diǎn)具多態(tài)性，以兩種等位形式存在。一種等位形式有正確的限制位點(diǎn)序列，能被酶切開；另一等位形式的序列有改變，從而該限制位點(diǎn)不能被識(shí)別。后者的結(jié)果是在核酸內(nèi)切酶處理后，兩個(gè)相鄰的限制片段仍然連接在一起，從而導(dǎo)致了長(zhǎng)度多態(tài)性（如圖1）。這就是一個(gè)RFLP的例子。如同用基因作為標(biāo)記一樣，RFLP在基因組圖譜上的位置可以通過(guò)追蹤其等位基因的遺傳而得到。人類基因組中大約有100000個(gè)RFLP，但是理所應(yīng)當(dāng)?shù)拿總€(gè)RFLP只能有兩種等位形式（有或沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)），這就限制了RFLP在人類基因作圖上的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)橐粋€(gè)家庭的所有成員很可能都是某一個(gè)RFLP的純合子。（簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，它不能區(qū)分純合子和雜合子）。
隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記
（Random Amplified Polymorphic DNA ，RAPD)RAPD技術(shù)是由Williams等首先創(chuàng)立的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，利用單一的10個(gè)堿基寡核苷酸作為引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA序列多態(tài)性。
擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性
（Amplified Fragment Length Polymorphism ，AFLP)AFLP是Zeabeau 等（1993）發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，它既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。其基本原理是通過(guò)PCR 擴(kuò)增基因組DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺電泳顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，其中引物=接頭+酶切位點(diǎn)+2～3個(gè)核苷酸。
AFLP技術(shù)分析流程：⑴DNA 模板制備；⑵提取樣本DNA 經(jīng)濃度和質(zhì)量檢測(cè)后，一般采用雙酶（EcoRI和MSEI或PstI或TaqI）酶切， 在基因組DNA上產(chǎn)生低頻和高頻切口；⑶選擇性擴(kuò)增酶切片段。酶切后，限制性片段在T4連接酶作用下與特定接頭連接，形成帶有接頭的特異性片段；⑷PCR前擴(kuò)增，一般用帶一個(gè)選擇性引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)條件與常規(guī)PCR反應(yīng)基本一致；⑸利用放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記PCR 引物；⑹在Taq聚合酶作用下完成94 ℃變性30s ，65 ℃淬火30s，72 ℃延伸60s，PCR擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)；⑺PCR產(chǎn)物在含尿素聚丙烯酰胺上電泳；⑻將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移到吸附濾紙上，經(jīng)干膠儀進(jìn)行干膠處理；⑼在X光片上感光，數(shù)日后沖洗膠片并進(jìn)行結(jié)果分析。
AFLP反應(yīng)起始一般高溫復(fù)性（一般65 ℃），因此只有那些與3’端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增，選擇性很強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，呈典型的孟德?tīng)柺竭z傳，每個(gè)AFLP可以獲得50～100條譜帶信息，多態(tài)性強(qiáng)。
微衛(wèi)星
（Microsatellite）微衛(wèi)星是指以幾個(gè)（1～6 bp) 核苷酸為單位，多次串聯(lián)重復(fù)序列，也稱之為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（single sequence repeats ，SSR） 、短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats ，STR）或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（single sequence length polymorphism ，SSL P）。廣泛分布于真核生物基因組中，大約每隔10～50bp就有一個(gè)微衛(wèi)星，由于重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度的不完全而造成每一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。
單核苷酸多態(tài)性
（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）基因組中存在單個(gè)的點(diǎn)突變，且數(shù)量極大，有些也對(duì)產(chǎn)生RFLP，但許多并個(gè)能。這是囪為它們所處的序列不能被限制件內(nèi)切核酸酶所識(shí)別。在人類基因組中，據(jù)認(rèn)為有200000個(gè)以上的SNP(single nucleotidc polymorphism）位干基因內(nèi)．而且有更多的SNP位于非基因的DNA中。
每個(gè)SNP只有兩個(gè)等位基因，所以這些標(biāo)記在人類繪制遺傳圖譜方面又與RFLP同樣的缺點(diǎn)：對(duì)于一個(gè)SNP，很可能—個(gè)家族的所有成員都是純合子。SNP的優(yōu)點(diǎn)是它數(shù)目龐大，而且對(duì)SNP分型所用的方法不需凝膠電泳。這非常重要，因?yàn)橐炎C明凝膠電泳很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，所以使用它的檢測(cè)方法相對(duì)緩慢而且費(fèi)力。由于SNP以寡核苷酸雜交分析（oligonucleotide hybidization analysis）為基礎(chǔ)，故其檢測(cè)更快速。寡核苷酸是在試管中合成的通常小于50個(gè)核苷酸的短單鏈DNA分子。在適當(dāng)?shù)臈l件下，一個(gè)寡核苷酸與另一個(gè)DNA分子僅在可形成完全的堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)時(shí)才能雜交。如果有一個(gè)錯(cuò)配，寡核昔酸上就有一個(gè)位置不能形成堿基對(duì)。則不能雜交（圖1）。因此寡核苷酸雜交能區(qū)分一個(gè)SNP的兩個(gè)等位基因。篩選策略包括：
DNA芯片（DNA chip）技術(shù)
DNA芯片是一塊面積為2cm平方或更小的硅片，以高密度排列方式攜帶有許多不同的寡核苷酸。待測(cè)DNA用熒光標(biāo)記后加到芯片的表面。用熒光顯微鏡觀察雜交情況，顯示熒光信號(hào)的位置即表示該處的寡核苷酸與待測(cè)DNA發(fā)生了雜交。因此一個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以量化許多SNP。
動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交（dynamic allele-specific hybridization,DASH) 在這種技術(shù)中，雜交在溶液中進(jìn)行，比如在96孔微量滴定板的一個(gè)孔中進(jìn)行G熒光標(biāo)記只能與雙鏈DNA結(jié)合，因此只有發(fā)生了雜交才能檢測(cè)到信號(hào)。開始，雜交在允許有錯(cuò)配的條件下進(jìn)行。在這個(gè)階段，無(wú)論待測(cè)DNA含有哪一種SNP等位基因，寡核苷酸都能與之雜交。由于錯(cuò)配的雜交產(chǎn)物不如完全雜交產(chǎn)物穩(wěn)定，故在較低溫度解鏈．因此可以通過(guò)升高溫度來(lái)區(qū)分等位基因。這樣就可以從使雜交依賴性熒光信號(hào)消失的溫度來(lái)判定待測(cè)DNA中存在哪一種等位基因。

利用RAPD可以鑒定兩個(gè)物種嗎？又是怎樣鑒定的？

可以

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）

RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美國(guó)杜邦公司科學(xué)家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。 Williams 稱之為 RAPD （ random amplified polymorphic DNA ） ， Welsh 稱之為 AP-PCR （ arbitrary primer PCR ）。 RAPD 技術(shù)建立在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上，它是以任意序列的寡核苷酸單鏈 ( 通常為 10 個(gè)堿基， AP-PCR 則為 20 ～ 30 個(gè)堿基 ) 為引物，對(duì)所研究的基因組 DNA 進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但對(duì)于任一引物，它同基因組 DNA 序列有特定的結(jié)合位點(diǎn)。這些特定的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件，即在一定范圍內(nèi)模板 DNA 上有與引物互補(bǔ)的反相重復(fù)序列時(shí)，就可擴(kuò)增出此范圍的 DNA 片段。在不同物種基因組 DNA 中，這種反相重復(fù)序列的數(shù)目和間隔的長(zhǎng)短不同，就可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物增加、減少或發(fā)生分子量的變化。 通過(guò)對(duì) PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)和比較，即可識(shí)別這些物種基因組 DNA 的多態(tài)片段。

與常規(guī) PCR 相比， RAPD 主要有以下特點(diǎn)： ① 無(wú)需專門設(shè)計(jì) RAPD 擴(kuò)增反應(yīng)的引物，也無(wú)需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機(jī)合成或是任意選定的。引物長(zhǎng)度一般為 9 ～ 10 個(gè)寡核苷酸。 ② 每個(gè) RAPD 反應(yīng)中，僅加單個(gè)引物，通過(guò)引物和模板 DNA 鏈隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增沒(méi)有特異性。 ③ 退火溫度較低，一般為 36℃ ，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對(duì)，同時(shí)也允許了適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對(duì)，以擴(kuò)大引物在基因組 DNA 中配對(duì)的隨機(jī)性。 ④ 較之常規(guī) PCR ， RAPD 反應(yīng)易于程序化。利用一套隨機(jī)引物，得到大量 DNA 分子標(biāo)記，可以借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)分析。

該方法已被廣泛用于遺傳指紋作圖、基因定位、系統(tǒng)進(jìn)化以及動(dòng)植物、微生物物種及中藥材的鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。在生藥鑒定方面，該方法在人參及其偽品、甘草、黃連、冬蟲夏草及其偽品、貝母等藥材的鑒定中有應(yīng)用。

/static/upload/image/2023/1120/domain_profile.cfm id='檉柳科的研究成果'>檉柳科的研究成果

中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所完成的《檉柳科植物研究》項(xiàng)目通過(guò)了專家鑒定。科研人員在檉柳科植物的屬、種劃分，系統(tǒng)與演化研究等方面取得突破性進(jìn)展，闡明了檉柳科屬植物的分布格局與環(huán)境的關(guān)系，建成世界上第一個(gè)檉柳科植物種質(zhì)資源庫(kù)。他們還提出檉柳科植物保護(hù)策略，成功克隆出3個(gè)具有獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗旱基因，為新疆的生態(tài)建設(shè)提供了檉柳苗木及檉柳栽培育苗技術(shù)。
專家認(rèn)為，其研究成果對(duì)檉柳科植物生物多樣性保護(hù)、可持續(xù)利用、干旱區(qū)退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建及科學(xué)管理具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。其研究思路與方法對(duì)干旱區(qū)其他植物資源研究與保護(hù)利用也有借鑒作用。
以中國(guó)科學(xué)院新疆生地所尹林克研究員為項(xiàng)目組長(zhǎng)的“檉柳科植物研究及生物多樣性保護(hù)”成果通過(guò)新疆自治區(qū)科技廳組織的專家鑒定。
該項(xiàng)目由四個(gè)相關(guān)課題組成：國(guó)家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目“中國(guó)檉柳科植物的及生物多樣性保護(hù)”；中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目“檉柳科植物的系統(tǒng)演化與應(yīng)用研究”；中國(guó)科學(xué)院生物區(qū)系特別支持費(fèi)項(xiàng)目“檉柳科系統(tǒng)學(xué)研究及中國(guó)檉柳科分類學(xué)修訂”；中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所領(lǐng)域前沿項(xiàng)目“檉柳抗?jié)B透脅迫的分子機(jī)理研究”。
該項(xiàng)目針對(duì)檉柳科植物的系統(tǒng)學(xué)研究及生物多樣性保護(hù)，做了大量的理論與應(yīng)用研究。首次采用多學(xué)科相互印證和專科專屬系統(tǒng)研究相結(jié)合的方法，解決了檉柳科系統(tǒng)學(xué)研究中長(zhǎng)期存在的科學(xué)爭(zhēng)議，在屬、種的劃分，系統(tǒng)與演化研究等方面取得了突破性進(jìn)展。闡明了檉柳屬植物的分布格局與環(huán)境的關(guān)系，首次利用RAPD分子標(biāo)記的方法分析了剛毛檉柳9個(gè)居群遺傳變異式樣及空間分布格局，提出基因流的隔離是造成遺傳分化的驅(qū)動(dòng)力。
建成了世界上第一個(gè)檉柳科植物種質(zhì)資源庫(kù)，是世界上收集檉柳科植物種數(shù)最多的專類園；首次構(gòu)建了白花檉柳的抑制性消減雜交文庫(kù)；成功克隆出三個(gè)具有獨(dú)立自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗旱基因。首次基于檉柳科植物的分布、基因交流能力、開發(fā)利用強(qiáng)度等，分析了檉柳科植物生物多樣性損失的動(dòng)因，提出了科學(xué)可行的檉柳科植物保護(hù)策略。項(xiàng)目為新疆生態(tài)環(huán)境建設(shè)提供檉柳苗木及檉柳栽培育苗技術(shù)服務(wù)，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。該成果對(duì)檉柳科植物生物多樣性保護(hù)、可持續(xù)利用、干旱區(qū)退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建及科學(xué)管理具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。研究思路與方法對(duì)干旱區(qū)其他植物資源研究與保護(hù)利用具有很好的借鑒作用。

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