從救命神藥到“基因編輯嬰兒”，CRISPR為何成為爭議的漩渦丨直擊諾獎

2020年諾貝爾化學獎授予了埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德納 ( Jennifer Anne Doudna），獲獎原因是開發(fā)了一種基因編輯的方法。

上一次這個名字進入大眾視野，還是2018年11月的“基因編輯嬰兒”。

基因編輯技術是什么？

是誰發(fā)明了這個相當于金礦的技術，又是誰讓它熠熠生光？為什么中間出現(xiàn)了利益之爭？ 卡彭蒂耶、杜德納和華人科學家張峰，有過怎樣的較量？

這些問題，將在本文一一解答。

如果盤點一下生命科學最近五年的大新聞，有一個詞是無論如何也繞不過去的，那就是“基因編輯”。

離我很遠，不明覺厲，偏偏又經常聽說——這也許是一般人對基因編輯的幾個印象。拋開媒體的種種稱贊反思深刻批判不談，咱今天就事論事地來講講，這基因編輯究竟是個什么東東，又能帶給我們些什么西西？

基因好好的，為什么要被編輯？

如果你想了解汽車某個零件的功能，你會怎么做？最簡單粗暴的辦法就是把這個零件拆了，改了或是多裝幾個，看看汽車會出現(xiàn)什么變化。

研究基因的過程差不多也是這回事：將生物的基因序列做某種改造，看看生物會因此出現(xiàn)什么變化，從而了解那個基因可能的功能。 把基因拆了、改了之類的操作，就可以叫做“基因編輯”。

不過，想拆螺母只要找個扳手，而編輯基因可就 艱難多了?；蚴菨摬卦诩氶LDNA鏈中的一段段序列。對于包括人類在內的多細胞生物來說，DNA被細胞層層疊疊的膜結構保護著，還有非常嚴謹?shù)腄NA修復機制應變?？梢韵胂?，細胞當中的DNA猶如一個身處于城堡之中的“小公舉”，身邊還有一大堆仆從侍衛(wèi)保護，想對它做什么手腳，并不簡單。

動物細胞的DNA被層層疊疊的膜結構保護著。：Mariana Ruiz/commons.wikimedia.org

因此數(shù)十年來，科學家一刻也沒有停止過尋找更高效的基因編輯工具。

派往基因的“特務”

經過仔細研究，科學家發(fā)現(xiàn)，那保護DNA的堡壘里安保人員雖多，但好在智商捉急。比如當基因受到損傷的時候，負責具體修復工作的蛋白質只是在細胞里拉一段DNA過來跟損傷的DNA比對一下，如果兩者長得差不多，拉來的那段就被當做模板拿去修復了。

上世紀八十年代，奧利弗·史密斯（Oliver Smithies）等科學家就想了一招：故意塞給細胞一堆“假模板”。他們首先根據(jù)需要人工合成一些DNA，并且故意把這些DNA序列設計得和某個基因的序列有點像，然后將它們塞到細胞里面去。細胞果然沒讓人失望，真的就 拿“假模板”張冠李戴地修復了真的基因，結果把基因“修復”成了科學家所希望的樣子。

奧利弗·史密斯（Oliver Smithies），遺傳工程的奠基人之一，他也因此分享了2007年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎。：Chemical Heritage Foundation/commons.wikimedia.org

這種被稱為“同源重組”的技術差不多就是最原始的“基因編輯”。只不過，這種“基因編輯”的前提是目標基因要自己出現(xiàn)損傷并啟動細胞的修復機制。然而，DNA本就被重重保護，難得出現(xiàn)一丟丟損傷，你還要這損傷剛好出現(xiàn)在某個基因上，這種事可遇不可求呀。

不過，科學家的服務向來貼（xie）心（e）：你細胞的DNA不容易受損傷，我就幫你受傷嘛——送個“特務”去細胞里搞破壞就是了。可難的是得讓這特務只破壞科學家希望他破壞的基因，而不傷無辜吃瓜基因分毫。這樣高素質的特務，當時科學家費了老鼻子勁在自然界中找了二十幾年也沒找出來。

到了21世紀初，他們心一橫想，既然世上沒有，那干脆人工造好了。于是，兩個“ 人造特務”出現(xiàn)了：一個是Sangamo公司主導研發(fā)的“鋅指核酸酶”（Zinc-finger nucleases，ZFNs），令一個則是由全球眾多科學家一點一點搗鼓出來的“轉錄激活因子樣效應物核酸酶”（tranion activator-like (TAL) effector nucleases，TALENs）。

ZFN（a）和TALEN（b）與目標DNA結合示意圖。：Doi: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004

ZFNs和TALENs都由兩個部分融合組成，其中一部分認基因特別準但是不懂破壞，另一部分破壞力超群但是臉盲。人們本希望這樣的組合可以各取所長，成為出色的人造特務。但實際用起來，ZFN太傻不好使喚，TALENs既不夠狠又不夠準。雖然能湊活用，但常常令科學家吐血三升。

不行，還得換。

2003年，西班牙微生物學家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）給《自然》雜志投了個論文，慘遭拒稿。后來這篇論文又相繼投遞給了《美國科學院院刊》《分子微生物學》以及《核酸研究》等一系列期刊，但也都遭到了冷落。

弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica），CRISPR系統(tǒng)第一個發(fā)現(xiàn)者。：Roberto Ruiz/University of Alicante Image Workshop

原因無它，因為這個研究的結論實在是太奇怪了。

莫伊卡在論文中指出，細菌和古菌當中廣泛存在一種免疫機制，可以記住之前感染過它們的病毒的基因特征，從而展開針對性的防御，大有“同一個招式不能對圣斗士用兩次”的意思。在當時人們的觀念中，這些單細胞的細菌、古菌何德何能有這種厲害的免疫系統(tǒng)？

直到2005年，莫伊卡的研究成果才被個比較一般的學術期刊《分子演化雜志》所接收。從此以后，一個新的術語開始進入了人們的視野——“規(guī)律成簇間隔短回文重復”（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），簡稱 CRISPR（讀作“克瑞斯破兒”）。[注1]

在隨后五六年里，CRISPR猶如一個吸引無數(shù)玩家參與的拼圖游戲，一塊又一塊的拼圖碎片被世界各地的玩家拼接到位。終于在2011年，屬于CRISPR的最后一塊關鍵碎片被?，敿~埃爾·卡彭蒂耶（Emmanulle Charpentier）拼了上去。 她的論文昭示了CRISPR作為基因編輯工具的實力——科學家們苦苦尋覓的那位“天然特務”，或許近在眼前了。

?，敿~埃爾·卡彭蒂耶（Emmanulle Charpentier），歐洲著名CRISPR專家，現(xiàn)代基因編輯技術的創(chuàng)始人之一。：Bianca Fioretti, Hallbauer & Fioretti/commons.wikimedia.org

技驚四座的CRISPR

當時，全世界研究基因編輯（那陣子還叫遺傳工程）的專家正被用起來如砂石咯牙般的ZFNs和TALENs弄得苦不堪言，卡彭蒂耶的研究自然逃不過他們虎視眈眈的眼睛。不久之后，卡彭蒂耶就在美國微生物學學會上，遇到了那個后來為她帶來無數(shù)榮譽與爭議的人——詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）。

詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna），美國著名結構生物學家與基因編輯技術專家，與卡彭蒂耶共同開創(chuàng)了第一代CRISPR/Cas9技術。：Mrl611/commons.wikimedia.org

杜德娜是加州大學伯克利分校的結構生物學教授，在此之前主要研究跟RNA有關的生物大分子結構。說起來，基因編輯只能算是她的“副業(yè)”，但是副業(yè)并不意味著業(yè)余。杜德娜與卡彭蒂耶合作不到一年時間，就發(fā)表了一篇在基因編輯史上里程碑性質的論文。

在論文中，她們先是證明了一種擁有SpCas9蛋白的CRISPR系統(tǒng)（注：自然界不同細菌和古菌的CRISPR系統(tǒng)都有所不同）最適合作為基因編輯的工具，因此后來這套基因編輯工具又被稱為CRISPR/Cas9技術。之后，她們又用這套系統(tǒng)成功編輯了大腸桿菌的基因，結果表明CRISPR/Cas9比起之前的ZFN和TALENs高到不知道哪里去。 CRISPR進軍基因編輯領域的第一槍，就此漂亮打響。

而當杜德娜和卡彭蒂耶還在波多黎各談笑風生時，一位來自麻省理工學院的科學家也敏銳地意識到了CRISPR的光輝前景，他的名字，叫做張鋒。

張鋒，CRISPR/Cas9技術創(chuàng)始人之一，世界最一流的CRISPR/Cas9專家，基因編輯技術的集大成者。：news.mit.edu

張鋒不是一般人。在哈佛讀本科期間，他師從于國際著名顯微成像大牛，差一點拿諾貝爾獎的莊小威。讀博時，他的導師是國際著名神經學技術大牛，長期掙扎著想拿諾貝爾獎的卡爾·戴塞爾羅斯。博士后時期，他工作在國際著名分子生物學大牛，準諾貝爾獎級研究者喬治·邱奇的實驗室。在麻省理工學院工作階段，他隔壁的實驗室則屬于一生多次與諾貝爾獎擦肩而過的魯?shù)婪颉ひ畠仁?/p>

從高中開始，張鋒已經接觸基因編輯領域。當杜德娜與卡彭蒂耶率先發(fā)表出她們的學術成果時，其他人可能因為痛失先機而發(fā)出一聲哀嚎，而張鋒卻一眼就看出了她們成果里那個小小瑕疵。

的確，CRISPR/Cas9是個好特工，但是杜德娜她們還沒有把這個特工訓練完全。對于細菌之類結構簡單，DNA缺乏保護的細胞，當時的特工或許可以勝任，但包括我們人類在內的各種動物的細胞有著層層膜結構，DNA可謂身居堡壘之中，而杜德娜她們開發(fā)的CRISPR/Cas9根本就無法“潛入”堡壘深處，連DNA的面都別想見著，根本是有力使不出來。

張鋒對CRISPR/Cas9做了幾處微小而巧妙的修飾，一舉解決了這個問題。在杜德娜的論文發(fā)表后半年左右， 張鋒成了第一個用CRISPR/Cas9編輯哺乳動物細胞基因組的科學家。[注2]

可這下事情就比較微妙了，如果說杜德娜和卡彭蒂耶發(fā)現(xiàn)了一座金礦，那么張鋒就相當于是最先找到了這個金礦中的金子。如果按照學術界誰先發(fā)現(xiàn)就歸誰的慣例， CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)，就成了一筆糊涂賬。

Cas9與引導RNA和目標DNA結合時的晶體結構示意圖。：doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001

名與利之歌：專利的游戲

化敵為友總是首選。一開始，張鋒及其盟友希望能拉攏杜德娜等人，他們合伙開了家名叫Editas Medicine的公司，想著到時候專利共享，豈不美哉?？上]過多久，杜德娜等人就和張鋒等談判破裂，單飛出去辦了一家名為Intellia Therapeutics的公司。兩個陣營關于CRISPR/Cas9的專利之爭，擺上了臺面。

按理說，杜德娜和卡彭蒂耶發(fā)表論文在先，申請專利也比張鋒他們早得多，優(yōu)勢很大。但這愣是被張鋒團隊一套組合拳給破功了。首先，張鋒團隊借助一系列司法解釋把CRISPR的專利拆成了好幾十份，從法理上把“金子”和“金礦”的所有權分了開來，然后又花錢走了專利審核的“快速通道”，讓他們的專利比杜德娜的更早獲得通過。最后，他們還巧妙運用了美國時任總統(tǒng)奧巴馬的一些新政策，提出這個專利的有效性要基于“誰先完成研究”而非“誰先申請專利”，為此張鋒瞬間掏出了過去兩年的詳細實驗記錄，明明白白地記錄著他早在杜德娜的論文發(fā)表之前就已經走在了她的研究進度之前（同學們，知道記實驗記錄的重要性了吧?。?。過了整整九個月，杜德娜團隊才整理出自己的實驗記錄來加以反駁。

2016年初，張鋒的上司，博德研究所所長埃里克·蘭德爾寫了一篇爭議巨大的綜述《CRISPR英雄譜》，把張鋒拔高到了無以復加的位置，而杜德娜則被歸進了為CRISPR基因編輯技術奠定基礎的蕓蕓眾生之中。那邊廂， 張鋒果斷宣布對學術界開放CRISPR/Cas9基因編輯的專利，只要研究不是出于商業(yè)目的，就可以隨意免費地使用。不僅如此，他還把自己的研究資源（主要是質粒）放到公共庫中，免費分發(fā)于天下。這一舉贏得了整個學術界的支持。

更重要的是， 張鋒團隊很快就把CRISPR/Cas9玩出了花——自2013年至今，張鋒發(fā)的論文之多足可用排山倒海來形容，隨便哪一篇開拓這一片科研新天地。自CRISPR/Cas9發(fā)明以來，其一半重大突破都出自張鋒之手，剩下的也多少用到了張鋒免費分發(fā)的科研資源，幾年下來，張鋒在基因編輯領域一哥的地位幾近無可撼動。2014年，美國專利商標局（USPTO)批準了張鋒所在的博德研究所的專利請求，來自加州大學的上訴也在2016年被悉數(shù)駁回。

不過杜德娜的團隊也不是吃素的。雖然博德研究所看似在美國全勝，可到了歐洲和中國等地，專利認證就站到了杜德娜一邊。除此以外，杜德娜和卡彭蒂耶還頻頻在各種高級學術獎項和學術峰會亮相，比如在2015年她倆就獲得了有豪華版諾獎之稱的“生命科學突破獎”。所以目前就世界范圍而言，兩撥人馬可謂勢均力敵。

杜德娜與卡彭蒂耶共同榮獲2015年生命科學突破獎。：independent.co.uk

神仙打架，技術得力

科學家們爭來爭去，其實也是因為CRISPR/Cas9造福于人的無限潛力。

作為定點破壞基因方面最強大也最便宜的“特務”，CRISPR/Cas9大大降低了修改基因，尤其是動物基因的成本與技術門檻。張鋒等人掀起的那一股編輯動物基因的風潮，正前所未有地席卷全球各地的實驗室。

現(xiàn)在，任何科學家想要研究一個動物基因，只需大手一揮：“給我把這個基因敲了！”“給我把那段DNA序列塞到這個基因里！”不消半年，就能“定制”一批基因修飾動物出來做研究。當年砸大錢問公司買動物模型的歷史，已經一去不復返。

中科院的科學家利用CRISPR/Cas9技術制作的基因敲除猴。在CRISPR/Cas9技術發(fā)明以前，制作基因敲除的靈長類幾乎是不可想象的事情。：doi:10.1038/cr.2017.81

將CRISPR/Cas9用在醫(yī)療上的嘗試也已不鮮見。2014年，美國貝勒醫(yī)學院教授張普民和他的研究團隊通過CRISPR/Cas9制造出了能夠產生人類白蛋白的特種豬。2016年初，來自三個機構包括張鋒在內的多個研究組試圖利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來治療動物的一種名為“杜興氏肌肉萎縮癥”的遺傳病，結果真的大大提高了它們的預期壽命和生活質量。而近期，喬治·邱奇的得意門生，張鋒的師妹楊璐菡所帶領的團隊也備受關注：他們試圖通過大規(guī)?；蚓庉?，讓豬產生適合移植給人類的器官。

這些案例都不過是冰山一角。隨著對CRISPR/Cas系統(tǒng)的理解越發(fā)深入，人們已經可以利用它執(zhí)行更多類型的基因編輯任務。如果從前它只是一個基因剪貼板，那現(xiàn)在幾乎能稱得上是基因編輯界的瑞士軍刀了。CRISPR/Cas引爆了全方位的技術突破， 毋庸置疑將生命科學帶來進了新紀元。

CRISPR會造出弗蘭肯斯坦的怪物嗎？

不過，CRISPR/Cas9再強大也終究是一種工具，而人類現(xiàn)在在遺傳學上畢竟道行尚淺，在某種意義上限制了工具的威能。就拿楊璐菡團隊的工作來說，為了讓豬長出可能適合移植到人類的器官，他們必須先清洗掉豬基因組當中的“內源性逆轉錄病毒”。

內源性逆轉錄病毒差不多就相當于已經被宿主“招安”了的病毒，兩者不再互相傷害，甚至有些時候病毒還能給宿主幫上點忙?？梢秦i的器官被移植到了人身上，豬的內源性病毒就又有了潛在風險。為了規(guī)避這些風險，楊璐菡專門把CRISPR/Cas9系統(tǒng)設計成“內源性病毒專殺工具”，將其注入豬的細胞中一次性消滅其中所有潛藏的內源性病毒。同時處理62個位點，那是CRISPR做過目標最多的單次編輯任務。

這第一步很成功。不過既然要的是豬器官，那只有細胞可不夠——她得把這些豬細胞克隆成真豬。做這第二步，楊璐菡的團隊用了兩年時間，投入了龐大的財力人力才把他們所需要的豬給成功克隆出來。為啥這么難，至今也沒人說得清楚。而如果真的要讓豬為人類提供器官，那么除了這種內源性病毒以外需要改動的基因少說還有上百個，其中每一個都潛藏著無法預料的困難。 CRISPR在基因組編輯層面的工作做得再出色，也需要在后續(xù)環(huán)節(jié)有成熟的技術跟進。

這也是為什么大家并不需要擔心，科學家會由于對基因理解有限而不小心造個弗蘭肯斯坦的怪物出來。要做任何事，一件工具永遠是不夠的，我們需要的是一個“工具箱”，然而很多事情能不能做成，往往取決于工具箱里最差的工具。

另一個限制則來自科學共同體的審慎。它來自人們對于基因編輯倫理問題的爭論。這場爭論最核心的觀點，就是人類胚胎（以及生殖細胞）的基因是否可以編輯——畢竟這種對基因的改變是會一代一代遺傳下去的。 在現(xiàn)階段，涉及基因組編輯的人類胚胎都在倫理委員會的監(jiān)管下，確保不能發(fā)育成活人出生。

（ 注：本文寫作于2017年12月。2018年11月，據(jù)人民網報道，南方科技大學生物系副教授賀建奎宣布，一對名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒于11月在中國健康誕生。）

基因編輯的故事，到這里也就暫時告一段落。對于這個生命科學領域最尖端的科技，人們憧憬著，可能也惶恐著。而技術終究有自己的發(fā)展規(guī)律，不為堯存，不為桀亡。CRISPR和它的后繼者們究竟能給基因編輯的故事續(xù)上怎樣的下一章？技術的研發(fā)者之間又能擦出怎樣令人喜聞樂見的火花？我們不妨擦亮雙眼等著看。

注釋：

注1：CRISPR這個名詞并非莫伊卡提出，不過在此之前人們并不知道這些東西有何意義，所以起了個就事論事描述性的名字。注2：確切地說，這個“第一”需要和喬治·邱奇共享，因為他倆同時發(fā)表了這方面的論文，不過一般認為喬治·邱奇該論文的政治意義大于學術意義，所以在此暫不贅述。 參考文獻

[1] Lander, Eric S. The Heroes of CRISPR. Cell. 2016. Volume 164 , Issue 1 , 18 – 28

[2] Capecchi, M.R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genet. 2005; 6: 507–512

[3] Charpentier, Emmanuelle, and Jennifer A. Doudna. Biotechnology: Rewriting a genome. Nature. 2013. 495.7439 50-51

[4] Lander, Eric S. "The heroes of CRISPR." Cell 164.1 (2016): 18-28.

[5] Luhan Yang. et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science. 2015. DOI: 10.1126/science.aad1191

[6] Niu D. et al. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science. 2017. Sep 22;357(6357):1303-1307. doi: 10.1126/science.aan4187.

[7] Nelson et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5143

[8] Long et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5725

[9] Tabebordbar et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science DOI: 10.1126/science.aad5177

作者：鬼谷藏龍

果殼

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crispr cas9怎么達到基因敲除的

近日，中國科學家利用基因編輯技術——CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達的“大力神”狗，成功構建了世界首個基因敲除狗模型。

科研人員所使用的“基因編輯技術”，顧名思義，能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優(yōu)勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

一、與諾獎“擦肩而過”的CRISPR/Cas9技術

這不是CRISPR/Cas9這項明星技術第一次得到人們的關注。在此之前，有著“豪華版”諾獎之稱的“2015年度生命科學突破獎”頒發(fā)給了發(fā)現(xiàn)基因組編輯工具“CRISPR/Cas9”的兩位美女科學家——珍妮弗·杜德娜和艾曼紐·夏邦杰。二人更是獲得了2015年度化學領域的引文桂冠獎——素有諾獎“風向標”之稱，曾被認為是今年諾貝爾化學獎的最有力競爭者。

那CRISPR/Cas9到底是一項什么技術，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時間內，發(fā)展成為生物學領域最炙手可熱的研究工具之一，并有近700篇相關論文發(fā)表？它將來又會如何影響到我們的生活？

CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點編輯技術”。與前兩代技術相比，其成本低、制作簡便、快捷高效的優(yōu)點，讓它迅速風靡于世界各地的實驗室，成為科研、醫(yī)療等領域的有效工具。

基因編輯技術是什么？它是如何在醫(yī)學領域應用的？

基因編輯技術不斷發(fā)展，到現(xiàn)在已發(fā)展到第三代基因編輯技術。第三代基因技術CRISPR/Cas克服了傳統(tǒng)基因操作的周期長、效率低、應用窄等缺點。作為一種最新涌現(xiàn)的基因組編輯工具，CRISPR/Cas能夠完成RNA導向的DNA識別以及編輯。通過一段序列特異性向導RNA分子（sequence- specific guide RNA）引導核酸內切酶到靶序列處，從而完成基因組的精確編輯，因其操作簡單、成本低、高效率，近幾年成為炙手可熱的基因編輯手段，目前已廣泛用于模式生物研究，醫(yī)療，植物作物，農業(yè)畜牧等領域。

1 磨快CRISPR利器，加快科學發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的出現(xiàn)給了科研人員無限想象的可能，基于CRISPR/Cas9的技術很快就被廣泛應用于全世界各個實驗室中，這里我們將主要介紹最常用的幾種應用。

早期，科研人員通過同源重組（HR）介導的基因打靶技術來實現(xiàn)基因編輯，但因效率太低，極大地限制了其應用。為了克服這一難題，一系列通過核酸內切酶介導的基因編輯技術被開發(fā)出來，通過這些核酸內切酶切割特定的基因組序列，借助細胞自身修復體系如非同源末端連接或同源重組修復方式，并由此達到改變基因組序列的目的，鋅指核酸內切酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）以及sgRNA介導的Cas9核酸內切酶正是基于此原理工作的。

鋅指核酸內切酶（ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）均可通過蛋白-DNA相互作用識別基因組上的特定DNA序列并完成特定位點的切割，但是它們因效率低下、可選潛在位點少、成本高等原因極大地限制了它們的應用，直到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)，科研人員才找到了一種成本低、效率高、簡單易用的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9出現(xiàn)之后，科研人員最先想到的便是將其運用到基因編輯上了，根據(jù)目標基因的外顯子序列設計single guide RNA（sgRNA）并與含有Cas9編碼序列的質粒一起轉入細胞，sgRNA通過堿基互補配對的原則引導Cas9蛋白靶向目標DNA序列，Cas9蛋白會在該位點切割DNA，引發(fā)DNA雙鏈斷裂（DSB），此時細胞通過非同源末端連接修復（NHEJ）完成DNA的自身修復，

因修復過程中常常發(fā)生堿基的添加和丟失，而最終導致基因的移碼突變從而達到基因敲除的目的，或者針對目的基因的上下游序列各設計一個sgRNA，從而引發(fā)該基因上下游同時發(fā)生DSB，再通過DNA損傷修復機制將斷裂的上下游兩端的DNA連接在一起，引發(fā)DNA片段缺失，從而達到基因敲除的目的。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒，細胞就會以此模板進行同源重組修復，如果引入的修復模板是一個想要插入的基因，便可在特定的位置進行基因敲入了。

2 神奇的dCas9多功能工具包隨著人們對Cas9研究的不斷深入，Cas9發(fā)揮功能的結構基礎也漸漸明確，在Cas9發(fā)揮切割DNA的功能時，它的兩個結構域發(fā)揮著重要作用，分別是RuvC和HNH，其中HNH結構負責sgRNA互補鏈的切割，切割的位點位于PAM的5'端的第三個堿基外側，RuvC結構域負責非互補鏈的切割，切割位點是在PAM上游的3-8堿基之間，當將這二者同時突變失活，便產生了失去DNA切割活性的Cas9蛋白了（dCas9），dCas9雖然失去了對DNA的切割能力，但依舊可以在sgRNA的引導下到達指定的DNA序列處，這是基于sgRNA–dCas9復合體的這一特征，若在dCas9上融合不同功能的結構域，便可在特定的DNA區(qū)域完成不同的修飾了，這便形成了基于CRISPR/dCas9的工具包了。

腦洞大開的科學家利用dCas9蛋白，開發(fā)出各種用途的工具，可謂是把CRISPR/dCas9利用得淋漓盡致，這里我們舉幾個簡單的例子如研究人員針對目標基因的啟動子序列設計sgRNA，使得sgRNA–dCas9復合體靶向結合到目標基因的啟動子上，因dCas9蛋白帶來的空間位阻可干擾轉錄因子的結合，從而引發(fā)在轉錄水平上的干擾基因表達的效果，而在此基礎上為了達到更佳的干擾效果，一些能夠引發(fā)基因轉錄阻遏的結構域也被融合到dCas9蛋白上，如KRAB（Krüppel-associated box）等。

既然可以通過CRISPR/dCas9實現(xiàn)基因表達的干擾，那是不是也可以通過CRISPR/dCas9實現(xiàn)激活基因表達呢？答案是肯定的?？蒲腥藛T通過向dCas9上融合vp64（四個串聯(lián)的vp16）、p65AD（p65 activation domain）等促進促進基因轉錄的結構域，實現(xiàn)基因的內源性激活，在經過各種優(yōu)化之后，比如由vp64、p65AD和VPR（Epstein-Barr病毒R反式激活因子Rta47）組成的三聯(lián)結構域（dCas9–VPR）就可以實現(xiàn)很高水平的內源性激活基因表達的效果了。

通過基于CRISPR/dCas9的基因表達干擾和內源性激活工具的建立，使得科研人員在進行諸如基因功能研究的工作時有了更為簡單、高效且低成本的研究工具。這很大程度上為科研人員節(jié)約了時間和成本。

3 精準編輯表觀遺傳修飾表觀遺傳研究是近些年來非?；馃岬念I域，DNA甲基化、組蛋白乙?；榷荚谏矬w中發(fā)揮著重要的生物學功能，而CRISPR/dCas9在表觀遺傳的研究中也成為了十分強大的工具。比如CRISPR/dCas9介導的靶向DNA甲基化修飾，我們知道在DNA甲基化過程中DNA甲基轉移酶（DNA methytransferases，DNMTs）起著關鍵的催化作用，而且大部分DNA甲基化都發(fā)生在CpG島，

因此研究人員嘗試著將DNMTs的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-Dnmt3a3L，并通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近催化其甲基化，以實現(xiàn)DNA甲基化的定點編輯。相似地，研究人員將在DNA去甲基化過程中起關鍵催化作用的TET1蛋白的催化結構域融合到dCas9上形成dCas9-TET1，同樣的通過sgRNA的引導靶向目標DNA序列的CpG附近，可以實現(xiàn)去甲基化修飾。

再如CRISPR/dCas9介導的靶向組蛋白修飾，與靶向DNA甲基化修飾相似，一些和組蛋白修飾相關的酶包括組蛋白去甲基化酶（LSD1/KDM1A）、組蛋白乙酰轉移酶以及組蛋白甲基轉移酶等也被融合到dCas9蛋白上，以實現(xiàn)靶向組蛋白修飾。

除以上的應用外，CRISPR/dCas9還被用于其他多個領域，比如將EGFP融合到dCas9上，通過sgRNA靶向特定DNA序列實現(xiàn)基因組成像。此外，還有研究人員開發(fā)出基于CRISPR/dCas9的enChIP技術，以來探測特定基因組區(qū)域上的DNA-蛋白質相互作用，通過sgRNA靶向特定基因組基因座的標記dCas9的抗體免疫沉淀，之后通過蛋白質譜（enChIP-MS），鑒定與之特異性相互作用的蛋白質。這些工具的開發(fā)都極大地幫助了科研人員，使得之前無法實現(xiàn)的操作成為可能，推動了生命科學的快速發(fā)展。

4 基因及藥物靶標基因的確定以往基于ZFN或TALENs的基因組編輯技術，需要針對DNA靶序列設計蛋白質，而CRISPR技術僅需要根據(jù)不同的靶序列合成相應的80nt左右的sgRNA來引導Cas9蛋白對序列進行修飾，這就實現(xiàn)了基因編輯技術的高通量應用。

CRISPR全基因組篩選技術可用于必需基因及藥物靶標基因鑒定。多倫多大學Jason Moffa研究組建立了覆蓋全基因組gRNA庫并在5個細胞系中逐個敲除了1.8萬個基因，最后鑒定出在不同細胞系間保守的1580個必需基因構成的“core fitness genes”。

同樣，美國達納-法伯癌癥研究所W. Nick Haining研究組通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)性地敲除了黑色素瘤細胞的2368個基因，發(fā)現(xiàn)ptpn2基因缺失會使這些癌細胞對PD-1阻斷更加敏感。華盛頓大學醫(yī)學院Michael Diamond研究組利用CRISPR/Cas9鑒定在宿主細胞中堅定了黃病毒感染所絕對必需的9個基因，其中spcs1基因缺失時，不僅降低黃病毒感染率，而且對細胞也不產生副作用，這將是一個潛在的黃病毒藥物靶標。

5 疾病建模及器官供體產生CRISPR/Cas9作為新一代基因編輯技術，同樣可被應用于建立疾病模型及培育供體器官?；蛑委熆蓪崿F(xiàn)在患者自身細胞中糾正遺傳缺陷，并結合其他生物學技術在體外培育出組織特異性的“類器官”，對于疾病建模、藥物篩查及臨床治療等方面研究有極大意義。CRISPR介導的基因組編輯技術可以直接應用于非人類哺乳動物的疾病模型建立，將更有利于疾病致病機理和治愈研究。

此外，CRISPR技術還可應用于大型動物的基因編輯以研究免疫排斥及跨物種的疾病傳染，從而解決異種移植器官來源的瓶頸，豬被認為是人體異種器官來源的首選動物，而目前豬器官用于人類的主要障礙為免疫排斥反應，及豬內源性逆轉錄病毒（Porcine endogenous retroviruses, PERVs）帶來的醫(yī)療風險問題。eGenesis公司楊璐菡博士與哈佛大學George Church教授利用CRISPR進行基因改造一步讓62個PERV pol 基因關閉，因而將來自PERV的傳染風險降低了三個數(shù)量級，成功培育出不含PERVs的豬品系，作為安全有效的異種移植器官來源，這些研究讓豬成為病人的器官來源更有前景。

6 基因療法基因編輯技術可以準確地改造人類基因，達到基因治療效果。中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組通過在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產生的后代是可育的并能將修正后的等位基因傳遞給它們的后代。杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）是一種罕見的肌肉萎縮癥，也是最常見的致命性遺傳病之一，是由肌營養(yǎng)不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學Charles Gersbach研究組應用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個截短的但功能很強的抗肌萎縮蛋白，這是生物學家“首次成功地利用CRISPR基因編輯技術治愈了一只成年活體哺乳動物的遺傳疾病”。

??CAR-T治療簡圖，圖片來自onclive.com

基因編輯技術聯(lián)合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應用前景。嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細胞療法在B細胞惡性血液腫瘤治療中已經取得碩果。中科院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術在CAR-T細胞中進行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國斯隆凱特林癌癥紀念中心Michel Sadelain研究組發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9技術將CAR基因特異性靶向插入到細胞的TRAC基因座位點，極大增強了T細胞效力，編輯的細胞大大優(yōu)于傳統(tǒng)在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中產生CAR-T細胞。

繼諾華的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應用CRISPR/Cas9基因編輯技術開發(fā)同種異體CAR-T候選產品。2016年10月，四川大學華西醫(yī)院的腫瘤醫(yī)生盧鈾領導的一個團隊首次在人體中開展CRISPR試驗，從晚期非小細胞肺癌患者體內提取出免疫細胞，再利用CRISPR/Cas9技術剔除細胞中的PD-1基因更有助于激活T細胞去攻擊腫瘤細胞，最后將基因編輯過的細胞重新注入患者體內。

7 致病菌及抗病毒研究微生物種群與人體醫(yī)學，自然環(huán)境息息相關。北卡羅來納大學Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統(tǒng)可靶向并區(qū)分高度密切相關的微生物，并程序性去除細菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統(tǒng)可開發(fā)成精細微生物治療體系來剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學Udi Qimron將CRISPR系統(tǒng)導入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細菌以消滅此類細菌，CRISPR系統(tǒng)已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發(fā)在噬菌體中開發(fā)CRISPR系統(tǒng)以達消滅難辨梭菌的目的。

弗吉尼亞理工大學Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進行M因子基因編輯，可以導致雌雄蚊之間的轉化或雌蚊的殺戮，從而實現(xiàn)有效的性別分離和有效減少蚊子的數(shù)量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

基于CRISPR治療不僅可以應用于根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應用于靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學Yuet Wai Kan在誘導多能干細胞iPSC中利用CRISPR系統(tǒng)引入純合CCR5Δ32突變后，誘導分化后的單核細胞和巨噬細胞對HIV感染具有抗性。天普大學Kamel Khalili 課題組應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在宿主細胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區(qū)，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

8 核酸診斷及細胞事件記錄Cas12a （Cpf1）屬于CRISPR家族另一核酸內切酶，它也可被gRNA引導并剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發(fā)了基于CRISPR的一項新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構建成一個報告系統(tǒng)，當CRISPR-Cas12a在gRNA引導下結合到目標DNA并發(fā)揮剪切作用時，報告系統(tǒng)中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統(tǒng)在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測HPV16和HPV18變現(xiàn)極佳。

布羅德研究所Feng Zhang研究組開發(fā)的基于CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活后，可以切割除靶序列外其他的RNA的特征，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實現(xiàn)一次性多重核酸檢測，可同時檢測4種靶標分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，并將它開發(fā)成微型試紙條檢測方法，簡單明了易操作，已被研究人員成功應用于RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測。

Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發(fā)了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細胞事件的“黑匣子”他們利用這個系統(tǒng)開發(fā)出兩種細胞記錄系統(tǒng)，在第一種被稱為“CAMERA 1”的細胞記錄系統(tǒng)中，研究人員利用細菌中質粒的自我復制但又嚴格控制其自身數(shù)量的特征，

將兩種彼此之間略有不同的質粒以穩(wěn)定的比例轉化到細菌中，隨后在接觸到外來藥物刺激時，利用CRISPR/Cas9對這兩種質粒中的一種進行切割，通過對質粒進行測序并記錄兩種質粒比例的變化來記錄細菌接觸外來刺激的時間。另一種細胞記錄系統(tǒng)被稱為“CAMERA 2”，它利用基于CRISPR/Cas9的堿基編輯系統(tǒng)實現(xiàn)在細胞內特定信號發(fā)生時改變遺傳序列中的單個堿基，以此實現(xiàn)對諸如感染病毒、接觸營養(yǎng)物等刺激的記錄。這套技術的出現(xiàn)將很大程度的幫助人們進一步了解細胞的各類生命活動的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

9 人類胚胎基因組編輯2015 年 4 月，中山大學的黃軍利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，同源重組修復了胚胎中一個引發(fā)地中海貧血β-globin gene （HBB）的突變。

??圖片來自kurzgesagt.org

2016年，廣州醫(yī)科大學的范勇團隊在三原核受精卵中，應用基因編輯技術CRISPR受精卵中的基因CCR5進行編輯引入CCR5Δ32純合突變由于當時脫靶效率問題突出，產生了鑲嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒岡健康與科學大學胚胎細胞和基因治療中心Shoukhrat Mitalipov研究組公布了其應用CRISPR在人類胚胎中進行DNA編輯的結果，糾正了突變的MYBPC3基因，其突變會引起心肌肥厚并將年輕運動員猝死。

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